[发明专利]MALDI-TOF质谱双内标及其定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸，蛋白，小分子多肽，及其它小分子样品的定量检测，是一种利用MALDI-TOF-MS对小片段物质进行检测时，引入已知浓度和比例的寡聚核苷酸作为标准样品，建立标样拟合曲线，用于校正实验误差的方法。

背景技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。

MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比 （M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF-MS的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知浓度和比例的内标，建立标样拟合曲线，可有效的校正质谱系统误差和分子量偏移。

目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，Jiangyue Wu 等( Anal. Chem. 1997, 69, 3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal. Chem. 2006, 78, 2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和MALDI-TOF-MS定量测定多聚物时，同样采用了拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的MALDI-TOF-MS定量方法。

发明内容

本发明原理是为了在使用MALDI-TOF-MS检测生物分子（如核酸、蛋白、多肽、有机小分子物质等）时，有效克服系统误差，而引入两种已知浓度的寡聚核苷酸作为实验双内标的定量检测方法。基于该原理，本发明还发明了用于该方法的三组寡核苷酸对。

    本发明的第一个目的是提供用作质谱检测的双内标志物（简称双内标）的寡聚核苷酸对，其选自LbC/LbT、MbC/MbT或HbA/HbG。

在一个实施方案中，上述寡核苷酸对分别选自：

检测低分子量待检物的LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；或

检测中分子量待检物的MbC(CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)和MbT(CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；或

检测高分子量待检物的HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。

在一个具体实施方案中，上述LbC/LbT的分子量分别为4753.04、4768.05道尔顿，上述MbC/MbT的分子量分别为6304.08、6319.09道尔顿，上述HbA/HbG的分子量分别为7913.12、7929.12道尔顿。 

    本发明的第二个目的是提供一种使用上述寡核苷酸对以用于建立质谱检测的内标标准拟合曲线的方法。

    在一个实施方案中，所述的方法包括：

1)      合成上述寡聚核苷酸对作为双内标标准品，备用；

2)      对寡聚核苷酸进行稀释；

3)      将寡聚核苷酸稀释到不同浓度范围，通过质谱检测得到合适的起始浓度；

4)      按不同比例将寡聚核苷酸配成混液，质谱检测，对所得到的数据进行分析，建立内标拟合曲线。

在一个实施方案中，步骤2的寡聚核苷酸稀释方法既可用常规方法进行稀释，也可使用本发明摸索确定的方法。其中，优选是选取相当于1OD₂₆₀的寡核苷酸干粉加500μl水进行稀释，充分振荡溶解，其中所选取寡核苷酸干粉的量的计算方法为：

寡核苷酸干粉量的摩尔数=1单位寡核苷酸质量/MW；

MW=(A碱基数x312)+ (C碱基数x288)+ (G碱基数x328)+ (T碱基数x303)-61；且