[发明专利]荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及荧光假单胞菌的检测技术，具体涉及荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒。

背景技术

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula）系假单胞菌属，4℃时繁殖速度快，是水产品生产、贮藏和销售过程中最易污染而引起腐败甚至人类疾病的微生物之一，也是3月份、5月份海洋陆源排污口的优势菌。假单胞菌的检测方法主要包括血清学检测(DAS-ELISA)、逆转录－聚合酶链式反应（PCR）技术和环介导等温扩增技术（LAMP）。如公告号为CN101403001的发明专利，就公开了由反应液、Bst DNA聚合酶、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成的试剂盒，用LAMP方法检测铜绿假单胞菌，其中反应液含有外引物和内引物的2对引物，其依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的2对引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异的扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1.5 h～2.5 h，检测周期非常短。目前还没有研究建立特异、灵敏以及操作简单的荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对荧光假单胞菌具有特异性高、检测周期短、成本低廉和操作简单的RT-LAMP检测试剂及及试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：荧光假单胞菌LAMP检测试剂，

包括特异性引物溶液，特异性引物溶液为F3 / B3引物溶液、FIP / BIP引物溶液和Y-LB引物溶液，所述F3 / B3引物溶液含有序列为F3：5′-GCGCGAATAC TTCAAGTCCA - 3′、B3：5′-GTACAGCTGC GAAGTCTGC - 3′的特异性引物；所述FIP / BIP引物溶液含有序列为FIP：5′-AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A - 3′、BIP：5′-TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG - 3′的特异性引物；所述Y-LB引物溶液含有序列为：5′-TCAACCACGG GGAGCAT- 3′的特异性引物。

上述引物系选择荧光假单胞菌的cDNA序列为靶目标，应用PRIMEREXPLORER V4（http://primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.htmL）软件设计合成，将设计的多对引物进行反应时间和反应温度进行优化试验，得到最合适的反应条件。该荧光假单胞菌的cDNA序列的的核苷酸序列为：

ATGTCAAAAG TAAAAGACAA AGCTGGAAGC GGCGAAATAC CAGCGACTTT AAGGATCGTC CTATCCCGGA TTAAGGAGGG TTTATTTAGA GTGGGTCCAT GAGATTAAGG ACCTACCTTC ATCAGATCAG TCCCGTATTT TCCAGTCCTG AAGCCGCCAG CAGGTTGCTG CGTCTGTTCG CGCTCATTCT TTTGGTTGGT ATCCTCGGAG CCGTCTACAA CTTCCTCAAC TCCACCCTCA GCAACGACAT TTCCCGGCGC CGCGGCTACA TGAGCAGCGC CATCGCCGAA GCCCAGACCT TCTTCACCAG CCGCGAGGCC TTGCTGGAAA GCCTCAGCCT GTCCGCGGTA CGCCGCTCCA   AGCAGGCCCA    GGCCCTGGTG    TACCTGCCCT     CCACCGAAGA