[发明专利]核盘菌草酸脱羧酶基因SsOXDC2及其在大豆抗病改良中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个源自核盘菌的草酸脱羧酶基因SsOXDC2的分离克隆和功能验证。草酸脱羧酶基因SsOXDC2能够赋予大豆抵抗由核盘菌引起的大豆菌核病的能力。 

背景技术

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种重要的植物病原真菌，寄主范围广泛，可以侵染75个科、450多种植物，主要是草本和多肉质的木本植物，引起植物菌核病(Purdy，1979；Boland et al，1994；Bolton et al，2006)，给多种经济作物的生产造成巨大损失。在我国，菌核病对大豆的生产成了巨大危害。 

核盘菌在致病过程中会分泌大量草酸，近年来的研究大都认为草酸与核盘菌的致病作用密不可分，草酸是其致病的决定因子(Maxwell et al.，1970；Godoy et al.，1990；吴纯仁等，1991)。草酸为核盘菌的侵染提供了一个酸性的微环境，侵染部位草酸聚集，pH值下降到4.5左右，酸性环境可以提高细胞降解酶活性，如多聚半乳糖醛酸酶(polygactu-ronase，PG)、纤维素酶和半纤维素酶(Riou et al.，1991)等。同时，草酸可以抑制植物抗性有关物质的活性(Noyes and Hancock，1981；Magro et al.，1984)。 

生物体内，草酸可以通过氧化和脱羧两条途径分解。参与草酸代解的酶主要有以下三类。草酸氧化酶(EC 1.2.3.4)，氧化草酸产生2分子CO₂和1分子H₂O₂，可从高等植物及少数微生物中克隆到。乙酰CoA脱羧酶(EC 4.1.1.8)系统主要与微生物有关。通过乙酰CoA脱羧酶，使草酸转化为草酰CoA和CO₂。草酸脱羧酶(Oxalate Decarboxylase，OXDC)(EC 4.1.1.2)，使草酸脱羧，产生1分子CO₂和1分子甲酸。草酸脱羧酶，最早发现于木腐担子菌冬菇(Collybia velutipes)及毛革盖菌(Coriolus hirsutus)的菌丝中，是一种含锰的酶。最近从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中得到了的草酸脱羧酶由酸性介质诱导，并非必需由草酸诱导。与其它草酸降解酶性比，草酸脱羧酶特异性地针对草酸，过程简单，在低pH值时具有活性。 

随着组织培养和农杆菌介导的植物转基因技术(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)的建立和发展，植物基因工程取得了丰硕的成果。目前关于大豆转基因研究，主要集中于对其抗虫性、抗逆性、抗除草剂、提高品质等特性，使用的基因主要包括Bt抗虫基因Cry1A、阿特拉津抗性基因、植酸酶基因、r-胱硫醚合成酶基因等，而关于大豆生产中最为主要的菌核病的抗性研究较少。表1列出了最近几年植物转草酸代谢酶取得的主要成果，仅少数基因曾尝试进行大豆的转化(Donaldson et al.，2001；Cunhaab et al.，2010)。由于酶催化的草酸降解反应发生在核盘菌侵染所创造的酸性环境中，而酶的效率受环境的影响非常大，因此源自于植物的草酸氧化酶的活性很可能会受到环境的影响而降低。而源自于核盘菌的草酸脱羧酶，对核盘菌侵染所创造的酸性环境有非常好的适应性，并且不会受到核盘菌分泌的与抑制酶活性有关物质的影响，因此可能在核盘菌与大豆互作中具有更好的表现。 

表1草酸代谢相关的基因在转基因植物中的应用 

发明内容

本发明的目的是分离克隆核盘菌中草酸脱羧酶基因，并采用病毒介导的表达策略在大豆中超量表达，高效利用此基因改良大豆品种抗菌核病的能力。 

本发明涉及分离和应用包含SsOXDC2基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：3所示。该基因(片段)赋予大豆对由核盘菌所引起的菌核病产生特异性的抗病反应能力。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括大豆、油菜等主要的油料作物和蔬菜作物。除上述所述的如SEQ ID NO：1所示的DNA片段外，本发明所定义的基因还包括基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO：1所示序列的亚片段。