[发明专利]N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。

背景技术

唾液酸(Sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，目前已经发现的天然的唾液酸衍生物达40多种。其中最主要的是N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac)。Neu5Ac通常位于细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链非还原末端，在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用：如细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。N-乙酰神经氨酸的生物学功能多样化，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，特别是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的预防和治疗方面有良好的效果。同时，N-乙酰神经氨酸可促进神经突触的发育，对婴幼儿脑部发育非常重要，因此也被用于婴幼儿奶粉添加剂。无论是药用前景还是作为食品添加剂，N-乙酰神经氨酸都具有较高的市场价值。

N-乙酰神经氨酸可从以下几种途径获得：天然产物提取、化学合成、化学酶法、酶法合成等。N-乙酰神经氨酸可从燕窝、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取纯化难，产量低(10-20％)，纯度低。

化学合成法合成N-乙酰神经氨酸，由于产物结构的复杂性，需要繁多的保护和去保护步骤。使用化学法合成N-乙酰神经氨酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，N-乙酰神经氨酸得率低。因此，化学法常常和酶法结合使用。

N-乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase，NanA，EC4.1.3.3)作用下生成N-乙酰神经氨酸。但ManNAc对于工业生产而言成本较高。化学酶法是一种更经济有效的生产N-乙酰神经氨酸的方法，即在碱性条件下，使GlcNAc异构化生成ManNAc；然后采用N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。或用双酶法合成：即用GlcNAc 2-异构酶(GlcNAc 2-epimerase，AGE，EC5.1.3.8)催化GlcNAc异构成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下缩合产生Neu5Ac。

在工业生产中多以GlcNAc为原料生产Neu5Ac，不论是采用化学酶法还是双酶法，都需要N-乙酰神经氨酸醛缩酶。虽然N-乙酰神经氨酸醛缩酶在高等动物及一些微生物中有存在，但是生物体中其含量极微，难以分离得到足够量的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。因此如何获得性质优良的N-乙酰神经氨酸醛缩酶对N-乙酰神经氨酸的生产非常重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因。

本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，名称为SaNanA，来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。

本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因，为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由882个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由293个氨基酸残基组成。

含有所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在载体6HisT-pRSET的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

所述重组菌为将所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述编码基因是通过所述的重组表达载体导入宿主菌中的；所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。