[发明专利]门冬胰岛素前体基因的优化及其高效表达

说明书

技术领域

本发明涉及基因改造与蛋白表达。通过优化密码子，获得可以用于高表达的门冬胰岛素前体基因序列。应用分子生物学技术进行目的基因合成和表达载体构建，并对目的蛋白的表达进行评价。

背景技术

胰岛素(insulin，Ins)是主要应用于所有I型糖尿病和大多数II型糖尿病患者的治疗药物。胰岛素的理想应用模式是模拟生理性胰岛素分泌的情况来满足能量代谢的需要。对于糖尿病(diabetes mellitus，DM)来说，通过胰岛素的治疗能有效的减少或缓解I型和II型糖尿病症状的发生和发展，因此，胰岛素已成为较为理想的治疗方法。虽然普通的短效人胰岛素应用比较广泛，但也存在一些缺点，特别是在是皮下注射之后，吸收和达到峰值速度与正常个体餐后胰岛素的分泌状态不同，进而使得药物浓度的峰值不能与餐后血糖高峰吻合，因此容易导致餐后高血糖和药物吸收后低血糖的发生。为了使胰岛素对糖尿病的治疗更为安全有效，新的短效胰岛素类似物不断得以开发。门冬胰岛素(insulin aspart，IAsp)便是其中一种快速作用的重组胰岛素类似物。

“诺和锐”是由丹麦诺和诺德公司研制的重组门冬胰岛素注射液。1999年9月得到欧盟批准；同年8月，9月和10月分别在瑞士、英国和德国上市。2000年6月得到美国食品药品监督管理局(FDA)批准，2002年8月获得中国国家医药管理局(SFDA)的批准，应用于I型和II型糖尿病患者的临床治疗。目前，门冬胰岛素作为一种常见的速效胰岛素类似物已经得到广泛应用。

与普通人胰岛素相比，门冬胰岛素由于B链28位的脯氨酸被门冬氨酸替代，减弱了溶液中胰岛素分子间的结合强度[Osterberg O,Erichsen L,Ingwersen S H,et al.Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of insulin aspart and human insulin.J Pharmacokinet Pharmacodyn,2003,30(3):221-235]，从而导致其迅速解离为二聚体或单体[Lindholm A,Jacobsen L V.Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin aspart.Clin Pharmacokinet,2001,40(9):641-659]。皮下给药吸收快于以同样方式给药的普通人胰岛素，因此可以更快达到最大血药浓度而且迅速回复到基线水平。而血浆清除率和生物利用度等参数与可溶性人胰岛素相比没有明显差异。主要通过胰岛素蛋白酶途径进行代谢，其代谢产物氨基酸和多肽随后用于合成其他蛋白质。

目前门冬胰岛素主要利用酿酒酵母来表达生产，该系统并不是十分理想。虽然酿酒酵母的产物的后期处理相对简单，但表达量较低[Zhang Y S.Hu H M.Cai R R.Secretory expression of a single-chain insulin precursor in yeast and its conversion into human insulin.Science in China,1996,39:225-233.]。相比之下，毕赤酵母可将甲醇作为唯一碳源进行高密度发酵，其乙醇氧化酶的启动子(AOX1)可控制异源蛋白大量表达，且其表达可通过甲醇供给进行严格调控。同时外源蛋白大都以分泌形式释放到胞外，产物后期处理同样简单。因此毕赤酵母是目前最为理想的真核表达系统之一。

胰岛素密码子优化的相关文献很多，如Gurramkonda等人优化的人胰岛素前体基因序列并在毕赤酵母的表达研究[Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insul in precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insul in.Microbial Cell Factories 2010,9:31]。门冬胰岛素前体基因序列很少报道，我们在以往的研究中参照了Gurramkonda等人优化胰岛素序列，并将其用于门冬胰岛素前体基因序列的优化，但是在毕赤酵母的表达效果仍然欠佳。因此，优化门冬胰岛素前体基因序列以提高目前门冬胰岛素前体的表达量，在产业化需求上具有重要的现实意义。