[发明专利]蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白抗原的多克隆抗体生产技术领域，具体的说是一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法。

背景技术

抗体是免疫学检测中重要的工具，其主要制备方法是通过抗原免疫动物激发机体产生免疫球蛋白(简称抗体)，然后通过提取纯化制得抗体以用于免疫学检测或作物治疗性药物使用，抗原生产的方法主要包括人工提取天然抗原和人工合成制备完全抗原两种。人工提取的天然抗原天然立体构象好，能更好的刺激动物机体产生免疫反应，获得的抗体具有效价高、亲和力高的优点，但由于很多天然抗原在自然界天然状态下存量极微，人工提取极为困难，提纯成本高，因此人工提取天然抗原难以得到有效推广；而目前人工合成制备完全抗原特别是蛋白抗原，主要通过多肽合成或重组蛋白来实现，重组蛋白的技术目前还受到技术的制约，表达成功率不高，仅为20％甚至更低；单一多肽合成技术由于肽链较短，导致免疫原性不好，另外由于蛋白序列的多样性，很容易与其它蛋白有序列重复，造成生产出来的抗体特异性不好。另外还有一种基因工程免疫法由于基因工程免疫法很少用于抗体的制备，并且需要借助分子生物学平台，并且成功率低，抗体效价低，目前仅仅停留在实验室阶段。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法，其方法简单、成本低、周期短、制得的抗体效价高。

本发明方法包括

(1)抗原表位选取与合成：选取具有至少2个有效多肽表位的蛋白抗原，然后根据该蛋白抗原的至少2个有效多肽表位的多肽序列分别合成至少2种多肽。

(2)多种多肽与载体的偶联：将合成的至少2种多肽与载体进行偶联制备出完全抗原，同一载体上同时偶联有至少2种多肽，每种多肽的摩尔数大于载体摩尔数；

(3)动物免疫及其检测：将上述完全抗原进行动物免疫，并采用酶联免疫吸附分析法检测动物免疫效果，得到相应的ELISA效价不低于1∶100,000的动物免疫血清；

(4)抗原亲和层析提取：将上述动物免疫血清通过天然抗原亲和层析方法提取出针对上述蛋白抗原的抗体。

所述步骤(2)中，每种多肽与载体的摩尔比为5-15∶1，优选为10∶1。

所述具有至少2个有效多肽表位的蛋白抗原的选取可根据蛋白抗原的性质进行筛选获取，或通过已发表的文献数据获得，然后将获知的多肽序列人工合成为多肽，需要几个有效多肽表位就可分别合成对应的几种多肽。

步骤(2)中的的载体可根据具体生产的蛋白抗体进行合理选择，如常用的牛血清白蛋白，卵清白蛋白或血蓝蛋白等。

将含有两个以上抗原表位的蛋白抗原的多肽表位分别合成出来后，然后将上述至少2种多肽经化学偶联到载体上，同一载体上可偶联多种多肽，如合成了4种多肽，则同一载体上同时偶联有4种多肽，并且每种多肽的数量大于载体数量(即同一载体上的同种多肽的数量大于1，优选每种多肽与载体的摩尔比为5-15∶1)，通过化学偶联后得到的完全抗原经免疫动物制备动物抗血清，再通过亲和层析提纯获得针对完全抗原的抗体。由于本发明的抗体制备方法中抗原通过至少2个多肽表位人为富集和多样化(即同一载体上偶联了多种多个多肽)，具有了一定的立体构象，并起到了一个协同放大效应，所以其抗体的免疫效果较单一表位多肽和重组蛋白免疫方法以倍数增加，从而得出的抗体效价高于单一表位多肽和重组蛋白免疫方法，更为接近通过天然抗原蛋白获得的抗体，这是单一表位多肽和重组蛋白免疫所无法模拟和达到的。

本发明方法(下称A法)生产的抗体比传统天然抗原免疫法(下称B法)相比，成本低，抗原容易取得，但是抗体效价稍有逊色；与重组蛋白免疫法(C法)相比，抗原制备简便，生产周期短(比C法生产周期短2周)、效价高；与传统单一多肽免疫法(D法)相比，抗体生产周期缩短，效价更高，抗体特异性好。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2采用本法生产的抗体效价比较曲线图。

具体实施方式

下面以制备人次级淋巴小结激酶蛋白(Germinal Center Kinase，以下简称GCK)为例对本发明作进一步的阐述，但是不作为本发明内容的限制。

一、抗原表位的挑取：