[发明专利]一种A40926的发酵工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种A40926的发酵工艺。

背景技术

达巴万星(Dalbavancin)中间体A40926是1984年科学家在培养分离来自土壤的马杜拉放线菌属菌种(Actinomadura)时发现的一种糖肽类物质。2003年将A40926的产生菌归类于野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.sp ATCC 39727)。A40926包括5个主要组份：PA，PB，A，B0和B1，其中B0和B1统称为B组份。A40926B组份经过化学结构修饰后可得到一种新型糖肽类抗细菌药物达巴万星。

达巴万星是由Vicuron公司开发研究，目前正处于III期临床试验。研究发现达巴万星作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，抑制G+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗皮肤和软组织感染的药物。并且，体内、外试验表明，达巴万星对于G⁺菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性；对耐G⁺病原菌包括耐青霉素和头孢曲松肺炎链球菌、替考拉宁不敏感CoNS、非vanA型肠球菌具有活性；对G⁺厌氧菌也具有活性。目前，达巴万星在治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染已取得了良好的效果，其优良的体内抗菌活性和安全性，具有更诱人的开发前景。

目前，对于A40926生产发酵工艺研究均较少。Technikova-Dobrova等人研究了不同培养基成分对野野村氏菌属放线菌ATCC39727生长以及生产A40926的影响时发现含为L-谷氨酰胺的NM-103培养基A40926产量较高，达到了122.6ug/ml，但若要生产应用，现有A40926产量很低显然不能够满足要求(Appl Microbiol Biotechnol，2004，65：671-677)。Beltrametti等人研究发现L-缬氨酸是A40926 B0组份的分支酰基链的潜在前体，在T/2培养基中添加0.3％L-缬氨酸，A40926总产量达到最高220u/ml(The Journal Of Antibiotics，2004，57(1)：33-44)；但是，此方法仅限于摇瓶试验，在工业生产规模的发酵罐上进行大规模生产工艺情况就不得而知了。鉴于现有的A40926发酵方法只是简单的摇瓶实验，且发酵单位低，达不到生产化的要求，该现状亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中A40926的发酵工艺的发酵产率低，仅限于简单摇瓶实验，无法达到生产化要求的缺陷，提供了一种操作简单、成本低、能够大规模生产，最高可生产720mg/L达巴万星关键中间体A40926的发酵工艺。

本发明的A40926的发酵工艺包括如下步骤：将产A40926的菌种接种到发酵培养基中进行发酵培养，其中，所述的发酵培养在培养至72h～112h，流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液控制葡萄糖0.5％～1.2％，蛋白胨0.3％～0.8％，L-缬氨酸0.05％～0.12％，百分比为各成分占发酵培养基总量的质量百分比。

本发明中，所述的产A40926的菌种为本领域常规所说的能够发酵生产A40926的菌种，较佳的为野野村氏菌属放线菌ATCC 39727(Nonomuraea.spATCC 39727)。

本发明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，发酵培养较佳的培养至88h～104h，更佳的为96h。

本发明中，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液步骤中，较佳的控制葡萄糖0.8％～1.0％，蛋白胨0.4％～0.6％，L-缬氨酸0.08％～0.12％。

本发明中，所述的蛋白胨为本领域常规使用的蛋白胨，较佳的为鱼粉蛋白胨。

本发明中，所述的发酵培养的发酵工艺在本领域常规使用的培养容器中进行，较佳的为发酵罐，更佳的为50L不锈钢罐。所述的葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的用量较佳的分别为发酵罐实际装液质量的1％，0.5％和0.1％，所述的葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液总体积较佳的为发酵罐实际装液质量12％，所述的流加含有葡萄糖、蛋白胨和L-缬氨酸的溶液的流加速率较佳的为0.8g/L.h～1.3g/L.h。