[发明专利]一种分离牛外周血单核细胞的方法

权利要求书

1.一种分离牛外周血单核细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

1)向含有抗凝剂ACD-A的离心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；

2)将OptiPrep^TM原液与C液按比例混合，制成密度分离液；

3)将1)的抗凝血液与PBS溶液按比例混合，制成稀释的抗凝血液；

4)将2份体积的3)稀释的抗凝血液加在1份体积的2)的密度分离液之上，离心，弃上清，将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中；

5)向4)的离心管中加入PBS溶液清洗细胞，然后以转速250g离心5-10min；

6)向5)的细胞沉淀中加入PBS溶液重悬，即得单个核细胞；

其中，2)中所述的C液的制备方法为：将1.79g Tricine Buffer加入100ml水中，制得100mM Tricine储存液，4℃保存；将0.85g NaCl加入50ml水中，加入20ml 100mM Tricine储存液，用1M NaOH调节pH值7.4，加水补充体积至100ml，0.22μm滤器过滤除菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的抗凝剂ACD-A的制备方法为：向100ml水中加入0.73g无水柠檬酸、2.20g二水柠檬酸钠和2.45g一水右旋糖，调节pH值至7.0-7.3，0.22μm滤器过滤除菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗凝剂ACD-A和牛外周血的体积比为1∶5-10。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中OptiPrep^TM原液与C液的体积比为1.4∶4.6。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中抗凝血液与PBS液的体积比为1∶1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5)和步骤6)之间重复一次清洗细胞的步骤。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将6)的细胞悬液转移至细胞培养瓶中，加入RPMI1640培养基，然后将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂的条件下培养，得到贴壁的单核细胞。