[发明专利]一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于将悬浮有人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到含Matrigel的海藻酸钠溶液中，在高压静电环境下喷入到氯化钙溶液中形成微球后与柠檬酸钠溶液进行离子置换反应，最终得到微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。

2.如权利要求1所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）、人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备

在CO₂培养箱中，人胰腺癌细胞在含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养液中，控制温度为37℃、CO₂浓度为5%的条件下对人胰腺癌肿瘤细胞进行生长培养，培养3天后传代1-2次；

取上述培养过程中处于对数生长期的人胰腺癌肿瘤细胞，以0.25%胰酶对其进行消化20min后，置于离心机中以500′g的速度离心15min，以4℃、pH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤三次，调节细胞数目至4′10⁷cells/mL，即得人胰腺癌肿瘤细胞悬液；

（2）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液的制备

按体积比即浓度为25%(v/v )的Matrigel：质量浓度为1.8%的海藻酸钠溶液为1:20，将浓度为25%(v/v )的Matrigel加入质量浓度1.8%的海藻酸钠溶液中，得到含Matrigel的海藻酸钠溶液；

然后加入步骤（1）所得的人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到上述所得的含Matrigel的海藻酸钠溶液中，使最终人胰腺癌肿瘤细胞浓度为2′10⁷cells/mL，即得含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液；

（3）、高压静电下形成胶珠

通过高频脉冲微囊制备仪，控制喷射速率为90mm/h，将步骤（2）所得的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液自上而下垂直喷射到质量浓度为1.1%的CaCl₂溶液中，形成胶珠；

上述的高压脉冲微囊制备仪喷射过程控制电压60kv，频率90Hz，脉冲6ms；

（4）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的多聚赖氨酸/聚海藻酸钠的包被

将步骤（3）所得的胶珠悬浮于质量浓度0.05％多聚赖氨酸溶液中5min，多聚赖氨酸与胶珠表面的海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊；

将形成的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊再悬浮于质量浓度0.1%的海藻酸钠溶液中10min，中和其表面正电荷；

（5）、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备

将步骤（4）所得表面正电荷被中和后的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊浸泡于质量浓度为3%的柠檬酸钠溶液中10min，用4℃、pH为7.2的PBS溶液洗涤微囊，最终得到本发明的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。

3.如权利要求2所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的人胰腺癌细胞为MiaPaCa-2。

4.如权利要求1、2或3所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞用于肿瘤动物模型的建立。

5.如权利要求4所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞用于肿瘤动物模型的建立，其特征在于所述的动物模型为皮下肿瘤动物模型或原位肿瘤动物模型。

6.如权利要求5所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在皮下肿瘤动物模型中的应用，其特征在于将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO₂的浓度为5%的CO₂培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′10²个/mL，取100mL注射于裸鼠腋下或肩背部皮下，即得含有微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的皮下肿瘤动物模型。

7.如权利要求5所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在原位肿瘤动物模型中的应用，其特征在于将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO₂的浓度为5%的CO₂细胞培养箱中培养6天后，调节微囊浓度至2′10²个/mL，取100mL原位注射于裸鼠胰腺包膜下，即得含有微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的原位肿瘤动物模型。