[发明专利]高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用，特别是一株经过离子束注入诱变选育获得的能够高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株及其应用，属于微生物技术领域。 

背景技术

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有双歧杆菌增殖效果好、生产原料来源广、耐酸耐热性能好等优点。目前，生产低聚半乳糖的厂家主要在日本，国内低聚半乳糖尚未形成规模生产，大部分处在研究阶段。 

β-半乳糖苷酶(又称乳糖酶)是制备低聚半乳糖的关键酶制剂，它能在特定的条件下水解β-D-半乳糖苷键，将乳糖水解成α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖，β-半乳糖苷酶同时也具有半乳糖苷转移作用，能把半乳糖连接到半乳糖和葡萄糖上，生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶一般都是从微生物中得到，根据不同来源可分为胞内水解酶和胞外水解酶，其中黑曲霉、米曲霉和米根霉等所产生的β-半乳糖苷酶均为胞外水解酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌所产生的β-半乳糖苷酶均为胞内水解酶。自然界分离出的菌种生产能力低，故而β-半乳糖苷酶的产量往往不能满足工业上的需要。因此，人工诱变方法常用于菌种选育，以获得高产目标代谢物的优良菌株，紫外诱变、化学诱变以及两者复合诱变是常用的诱变源。离子束注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，诱发生物细胞的生理、生化性能和碱基改变，引起染色体结构变异。王岁楼等(食品科学，2009，Vol.30，No.05，135-140)用低能N+注入黏红酵母高压突变株，使其β-胡萝卜素产量由出发菌株的9.64mg/L提高到17.36mg/L，增加了80.08％。王菊芳等(原子核物理评论，第26卷，第3期)利用C离子束对高产酒精酵母菌株进行了辐照诱变，得到5株产酒精能力提高的突变酵母菌，T4突变株的产酒精能力比原始出发菌株提高了18.6％。 

胞内酶的分离提取技术属于生物工程下游技术，一般包括细胞破碎、酶与细胞碎片分离、酶纯化、酶浓缩等步骤。专利文件CN1916170A(申请号200610010516.X)介绍了一种中性乳糖酶的提取方法，包括酶法预破壁处理、冻融破壁、高压匀浆破壁三道工序，但是该方法工艺设备要求高、生产成本高，很难满足工业化生产的要求。本发明中的β-半乳糖苷酶为胞内酶，β-半乳糖苷酶高效、低成本分离提取技术是实现低聚半乳糖产业化的必要条件。 

β-半乳糖苷酶对乳糖的水解、转苷反应存在产物抑制现象，导致乳糖水解率低、低聚半乳糖含量不符合要求等问题，后续常需要增加膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序来提高低聚半乳糖含量，这些工序降低了产品收率，使生产成本大幅度增加。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用。 

发明概述 

本发明通过离子束注入方法诱变选育一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22，产酶量达到出发菌株的5倍，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平；开发出胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术；并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60％的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题，大幅度降低了生产成本，具有良好的工业化价值。 

发明详述 

一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22，该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。 

上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。所述应用，步骤如下： 

(1)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基，在温度28-30℃培养14-38小时，然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下，得菌液；