[发明专利]基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品中微生物学检验的技术领域，具体涉及一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法。

背景技术

牛奶营养价值高，但易变质、易腐败。在牛奶的生产、运输、销售过程中，还可能受到多种细菌的污染，其中含有很多潜在的有害微生物，这些微生物不仅破坏牛奶质量，而且可能危害饮用者身体健康。传统的微生物检测技术非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长，按国标GB/T4789.2进行检测，菌落总数的结果需要48h才能得出，难以满足食品安全检测的要求。目前，聚合酶链反应法(PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等几种快速检测技术被应用于检测致病菌，虽然比传统方法需要的检测时间缩短了不少，但检测费用高、仪器昂贵；传统的电阻抗技术亦可应用于细菌的检测，但在分析含菌量较少样品时，检测时间较长，且只有当微生物数目达到10⁶-10⁷个/ml时这种电阻的变化才能被记录到，不能满足日常检测要求。因此开发一种快速、简易的适合于牛奶样品中细菌检测的方法在现阶段极为迫切，本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，该方法不需要预处理，操作简单，结果准确，检测时间短、费用低，解决了现有技术中检测时间长、检测灵敏度低、检测费用高等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种基于功能化纳米金电极的快速检测菌落总数的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)制备功能化纳米金电极：以pH为7的磷酸盐缓冲溶液为修饰液，通过控制电位电解的方法在金电极上施加1.8-2.2V恒电位下电解修饰480～600s，形成金电极表面纳米功能化处理的功能化纳米金电极；

(2)获得标准曲线：对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系以细菌浓度为横坐标，以电流响应值为纵坐标，建立细菌浓度-响应电流标准曲线；

(3)以步骤(2)获得的细菌浓度-响应电流标准曲线为参照，通过使用功能化纳米金电极为工作电极的检测器用计时电流法测定待测样品的电流响应值，根据步骤(2)获得的细菌浓度-响应电流标准曲线获得待测样品的每毫升样品细菌总数。

优选的，所述方法步骤(2)还包括对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的步骤；所述对获得的细菌浓度-响应电流标准曲线进行验证的方法包括在对已知浓度的标准样品用计时电流法进行测定的同时通过标准平板计数法对同一标准样品进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，根据电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系对建立的细菌浓度-响应电流标准曲线进行校正得到校正后的细菌浓度-响应电流标准曲线。

优选的，所述方法步骤(2)最后得到的细菌浓度-响应电流标准曲线为一直线，对该细菌浓度-响应电流标准曲线进行拟合得到响应电流与细菌浓度的关系公式为：ΔI＝k＊C，其中，ΔI为样品产生的电流与空白值电流的差值，单位为微安(μA)；k为常数，C为细菌浓度，单位为细菌数/毫升(cfu·mL^-1)。

优选的，所述方法步骤(1)中金电极进行电解修饰前需要进行抛光清洗处理，其工序包括依次用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉在绒布上对金电极进行抛光，然后用二次蒸馏水冲洗，依次在HNO₃溶液、无水乙醇及二次蒸馏水中超声波清洗处理，清洗后的金电极烘干备用。

优选的，所述方法步骤(1)制备的功能化纳米金电极在进行使用前需要在0V～1.5V的范围内循环伏安扫描至电流稳定，完成后用二次蒸馏水反复冲洗，储存在二次蒸馏水中待用。

优选的，所述方法步骤(2)对已知浓度的标准样品进行测定的工作条件是：以功能化纳米金修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，以经高压灭菌的0.05～0.15mol·L^-1、pH6.8～7.40的磷酸缓冲溶液为电解质，工作电压为0.8～1.2V，测定时将电解池置于30～40℃的恒温水浴中，待基线电流稳定后，用无菌微量注射器将已知细菌浓度的菌悬液连续加入检测池中进行测定。

优选的，所述方法步骤(3)的检测条件与步骤(2)的条件相同，等基线电流稳定后，用微量注射器连续加入10～20μL时待测样品进行检测。