[发明专利]具有蒜氨酸酶活性的骆驼单域抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种制备催化抗体或抗体酶的通用方法及所获得的具有蒜氨酸酶活性的骆驼来源的单域抗体，及这些抗体的应用。

技术背景

抗体酶(abzyme)，也称催化抗体，兼具酶的专一催化作用和抗体的靶向作用，在研究和应用中具有重要价值。然而，由于抗体酶制备过程复杂、制备难度大，尽管1986年就得到了第一个人工合成的抗体酶，然而到目前为止，有实际应用价值的抗体酶报道的并不多[1]。

当前，制备抗体酶的方法主要有两种：一种是采用酶底物过渡态中间类似物作为抗原[2]，免疫动物后筛选能结合过渡态中间类似物的抗体，该抗体可能具有酶的活性。这种方法一方面需要合成大量过渡态中间类似物，并且需要与载体蛋白进行偶联后免疫动物，过程复杂，结果不易控制；另一方面，免疫动物可能不易激发针对过渡态中间类似物的抗体。所以，采用该方法筛选抗体酶成功的几率并不高。第二种方法是采用抗独特型抗体模拟抗原作为抗原内影像[3-5]。该学说认为能与抗体(称为Ab1)中的抗原互补结合区(complementarity-determining regions，CDR)结合的抗体(称为Ab2，也叫抗独特型抗体，anti-idiotypic antibody)，可以模拟抗原的性质，即相当于抗原的内影像(其原理见示意图1)。因此，可以通过筛选结合图中Ab1的抗独特型抗体来获得抗体酶。但该方法成功的关键是首先需要获得能与作为抗原的酶活性中心结合的抗体(Ab1)[6]。这对于由两条重链(heavy chain，H)和两条轻链(light chain，L)组成的常规抗体来说，是比较困难的。因为常规抗体的抗原互补结合区(CDRs)是由重链可变区(variabledomains of the heavychain，VH)和轻链可变区(variable domains of the light chain，VL)共同组成，在空间结构上呈扁平或凹陷的结合槽[7-8]。这种结构不利于结合位于蛋白裂隙中的抗原表位，像酶的活性中心就是这样的表位。事实上，目前得到的具有酶抑制作用的常规抗体很少。所以从常规抗体库中筛选得到具有酶活性的抗独特型抗体也比较困难。因此，抗体酶尽管具有独特的优点，在基础研究、药物开发等领域有着诱人的应用前景，但由于没有可靠和可行的制备手段，限制了其广泛应用。

近年来，在对骆驼科动物的研究中发现[9]，双峰驼、单峰驼、羊驼和美洲驼中存在一种天然缺少轻链，仅由重链组成、但具有完整功能的抗体，称为重链抗体(heavy chain antibody，HCAb)(其结构见示意图2)，其可变区仍具有很好的抗原识别和结合能力，与抗原结合的亲和力和常规抗体相当。重链抗体的可变区(variable domains of the HCAb，简称为VHH)，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10，是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分子片段，称为单域抗体(single domain antibody，sdAb)。更为独特的是，骆驼单域抗体的抗原结合区仅由VHH的三个超变区(H1-H3)组成，在空间上形成了与常规抗体典型结构不同的抗原结合域[8，10]。其中H3的平均长度比常规抗体长，在空间上可呈突出的指状结构[8，10]。因此单域抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。最近多项研究均表明[11-17]，从经过酶免疫的骆驼VHH抗体文库中筛选得到了很高比例的酶抑制性单域抗体。另外，由于在框架区FR2中有四个位点被亲水性氨基酸替换(V37→F或Y；G44→E；L45→R或C；W47→G)[19]，重组的VHH在大肠杆菌中可以获得高表达(5-10mg/L)，并且具有水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性强等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景[18-19]。

单域抗体优先识别酶活性中心的特性，使得它们非常适合作为酶的分子模拟以及作为抗独特型抗体疫苗。Zarebski LM[20]从特异结合DNA寡核苷酸的单抗ED84免疫的美洲驼VHH抗体库中，筛选得到了两个抗独特型抗体，都能竞争抑制ED84与双链DNA寡核苷酸的结合，表现出对该DNA功能上的模拟。但迄今未见采用骆驼抗独特型抗体获得抗体酶的报道。本发明根据抗体独特型网络学说，采用与酶活性中心特异结合的单域抗体，从经过酶免疫的骆驼VHH抗体库中筛选得到具有酶活性的抗独特型抗体。