[发明专利]用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型及其建立方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是涉及一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，以及将该该模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法。

背景技术

血管新生(angiogenesis)，指成人在原始血管丛或已存在血管的基础上以出芽的方式形成新生血管的过程，具有维持人体正常的生长和平衡的功能，在许多疾病的发生、发展及转归、预后中扮演着重要的角色。近年来，调节血管新生的研究已成为临床治疗中的热点。血管新生主要涉及基底膜的降解、内皮细胞迁移、增殖和管形成等过程，其中内皮细胞的增殖是血管新生的最主要指标之一。同时，内皮细胞功能障碍和死亡还是冠心病、中风、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的重要病理过程。然而由于心血管疾病引起的死亡在疾病死亡率排行版中长居前三甲，因此，临床上一直且迫切的希望发现一种能够有效调节血管新生，保护内皮细胞功能的药物。

关于血管新生方面的研究，目前已有多种体内体外的模型。比如，体外的模型有，内皮细胞的增殖、迁移、分化模型；相对于体外模型，体内的模型有着更多的生理系统，从而可以从整体上展开对血管新生深入的全面的研究，比如鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型，斑马鱼及转基因斑马鱼模型，小鼠的角膜血管新生模型，肿瘤细胞诱导的小鼠背气囊模型等等，在上述诸多模型中，都能有效的筛选出血管新生潜在的药物，但是随着血管新生研究的越来越深入，以斑马鱼为模型用来研究及筛选血管新生类的药物逐渐被人们所认可。而斑马鱼在血管新生研究中的诸多优势为该类研究提供了便利，比如高产蛋率从而提供了充足大量的实验材料，斑马鱼的基因以及血管新生的调节机理与哺乳动物大量的相同使得该模型的研究更有意义，透明的胚胎与转基因技术(Tg(fli-1：EGFP))相结合使得神秘的血管循环系统成为可见等等。

然而，目前将斑马鱼用来研究血管新生及血管新生药物的筛选都是基于正常的斑马鱼。比如，抗血管新生药物的筛选根据其对斑马鱼胚胎时期背部节间血管(ISV)的影响来判断的，而促血管新生的药物的筛选主要是根据其对斑马鱼胚胎时期肠下静脉血管(SIV)的影响来判断的。该方法的优势是根据血管新生的血管的特殊形态能够直接快速的发现潜在的血管新生的药物，但是美中不足的是以此方法筛选出的药物对于血管新生类疾病的治疗是不能确定的，换句话说，在正常模型中有效的药物不一定在病理模型中有效，因此，病理模型的药物筛选对于药物治疗效果的要求更为直接也更有意义。然而感到遗憾的是，在斑马鱼这个优秀的研究血管新生的模型中尚未建立一个效果显著，稳定及被认可的血管的病理模型。

发明内容

本发明的目的是克服现有的技术的不足，提供一种斑马鱼血管损伤模型，其为病理模型，能够模拟体内血管新生不足的环境进行快速筛选具有促血管新生类的药物。

本发明的另一个目的是提供上述斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其操作简单，造模成功率高。

本发明还有一个目的是将上述斑马鱼血管损伤模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法，其操作方便、实验结果稳定准确、所需受试药物少、成本低。

为实现以上的目的，本发明采取的技术方案为：一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于包括以下顺序步骤：

(1)取受精后24-28小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后；

(2)加入浓度为100～600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3-4小时；

(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。

上述方法制得的用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型。

一种筛选抗血管损伤药物的方法，其特征在于包括以下顺序步骤：(1)采用上述的斑马鱼血管损伤模型作为空白对照组及受试药物组，取正常生长的且生长时间相同的斑马鱼胚胎为正常对照组，每组斑马鱼数量相等为5-15条；将所配好浓度的受试药物加入到受试药物组的水溶液(胚胎培养基)中，正常对照组和空白对照组则加入等量的溶媒的胚胎培养基；(2)给药24，48，72小时分别用荧光显微镜观察血管的形态，并且在给药24小时检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-1A，Flk1-B，Flt1)基因表达的水平的变化。

本发明针对本领域无类似技术而提供了斑马鱼血管损伤模型及其建立方法，以及将斑马鱼血管损伤模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法中，克服了现有的技术的不足，操作方便、造模成功率高、可以模拟体内环境快速筛选、实验结果稳定准确、所需受试药物少、成本低，应用范围广泛，工作效率高。

附图说明