[发明专利]一种外周血单核细胞的富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种外周血单核细胞的富集的方法。

背景技术

大量的实验及临床研究表明，树突状细胞（DCs）治疗技术是一个非常具有前景的免疫治疗手段，尤其在肿瘤治疗方面。然而，它的临床实际应用由于受到了多方面因素影响而一直未能有大的突破，其中原因之一就是缺乏一种有效并易行的手段以提供在质量和数量上都能满足治疗需要的树突状细胞。

由于外周血中树突状细胞数目有限，直接从外周血中富集治疗所需的树突状细胞不太现实。现有报道中的树突状细胞主要来源于在细胞因子诱导下外周血单核细胞（MCs）的体外分化。因此，外周血单核细胞的富集和纯化过程是树突状细胞治疗实施的关键之一（现有技术中MCs一般需要纯化到80%以上方可用于临床，保证治疗效果以及安全性）。虽然目前已有的技术手段如细胞贴壁吸附，免疫选择技术等都能达到一定的质量和数量上的要求，但它们大都需要配置昂贵的符合GMP条件的实验室设施和相对高的人员素质要求，对临床应用存在着诸多的不便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外周血单核细胞富集方法，该方法可操作性强，耗时短，得到的产品产量、纯度较高，适用于临床的推广。

本发明的技术方案如下：

本发明的一种外周血单核细胞的富集方法，采用血细胞采集结合离心淘洗。

其中血细胞采集采用的抗凝剂与全血的比率为1：5 -1：20。

抗凝剂与全血的比率为1：12-1：13。

血细胞采集过程所处理血量为自身血容量的2-4倍。

血细胞采集过程中给予患者静脉钙剂的输注。

    如所述的富集方法得到的外周血单核细胞在肿瘤治疗中的应用。

血细胞采集分离结合离心淘洗技术（Centrifugal  Elutriation）的原理是基于细胞的物理性质而通过离心分离的，相比于抗原-抗体结合为原理的免疫选择技术而言所得到的细胞产物可能更加“纯朴”。我们的富集结果也表明，该方法得到的产品纯度较高，此外还具有临床适用性高、产量大的特点。

相对于较为成熟和一致的由MCs到DCs的体外诱导分化方法而言，用于DCs治疗为目的的MCs的富集及纯化在业内尚无较为统一的方法。我们的应用结果表明，基于离心淘洗技术为基础的MCs富集及纯化方法是较为非常理想的方法，具体表现如下。1）临床适用性：自动化设备的应用省去了许多对临床单位来说相对苛刻的要求，由于所有的采集及分离过程均在密闭体系中进行，无需附加的符合GMP条例的实验室设施。其次，时效性极高，MNC采集结束后的一个小时左右即可得到纯度高的MCs终产物。2）可靠的产品质量：由于细胞淘洗技术的原理是基于细胞的物理性质而通过离心分离的，相比于抗原-抗体结合为原理的免疫选择技术而言所得到的细胞产物可能更加“纯朴”。 3）充足的产量：由于现代DCs治疗需要足够量的细胞以满足多次、系列注射的需要。

具体实施方式

1        对象  计划接受DCs治疗的癌症患者共17位，其中卵巢癌患者9例，乳腺癌患者和黑色素瘤患者各4例。

2        方法及原理  首先采用血细胞分离机采集外周血单个核细胞（MNC），然后利用自动化细胞淘洗设备将初步收集产物根据细胞大小及密度的不同分离成不同的细胞成分。所有患者进行MNC采集前都经历过化疗或放疗，MNC采集时间与最后一个化疗或放疗的疗程间的间隔为至少2-3周。

3        2.1 MNC采集   所有患者应用COBE SPECTRA 血细胞分离机的AUTO PBSC 程序（美国CARIDIAN BCT公司）进行大处理量的MNC 采集。大处理量的定义为处理血量至少为自身血容量的两倍，使用的抗凝剂ACD-A与全血的比率为1：12 到1：13。采集过程中，所有患者给予静脉钙剂的输注以避免枸橼酸相关的副反应的发生。

2.2 细胞淘洗   MNC初级产物经细胞计数后将相关数据（包括白细胞数、红细胞数、总体积）输入 Elutra Cell Separation System 细胞淘洗机（美国CARIDIAN BCT公司产品）中。根据设备提示接通一次性使用的密闭管道，设备将自动运行并生成五个不同的成分同时分装于五个不同的密闭塑料袋中。

2.3 细胞计数   收集患者MNC采集前、后外周血，MNC初级产物及五个不同成分的样本分别予以细胞计数。

3  数据统计   所有数据以mean±s表示，外周血单核细胞的回收率计算=终产品中外周血单核细胞绝对数×100%÷MNC初产品中外周血单核细胞绝对数.