[发明专利]预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法

说明书

所属技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种能够预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法。

背景技术

在大棚蔬菜大量种植的今天，由于大量使用化肥、农药，使得土壤生态系统受到严重破坏，再加上经济利益的驱使重茬种植普遍盛行，更使得土壤生态系统难以修复。近些年在大棚蔬菜的种植中各种病害、虫害增加，如根腐病、黄苗、花叶、枯萎病以及线虫虫害等，都是土壤生态系统遭受破坏的明证。为了改变这种现状，就必须从修复土壤生态系统入手，增加土壤中的有益菌，从而抑制那些容易感染植株病害的细菌和真菌。采用细菌-真菌联合、多菌种联合的技术方法，达到修复土壤生态系统，防止根腐病、枯萎病等重茬病，同时促进根生长，松土壮苗。益根生菌剂还具有降解农药、化肥残留污染的作用。菌剂经发酵工程完成后有效活菌数(cfu)在20亿以上即2-3×10⁸cfu/g。采用细菌-真菌联合预防大棚黄瓜重茬病益根生菌菌剂及其高密度、高活性的生产工艺还未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种高密度、高活性的预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂制备方法。

本发明的技术设计构思是：

抗重茬益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂生产的菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的灭菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillus subtilis)、

地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝孢酵母CGMCC2.1193(←ACCC20055)(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)、多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacillus polymyxa)和金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)的等质量混合物，对发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的菌剂。

本发明中所用菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中国科学院微生物研究所。

培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。

灭菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。

所述的发酵过程包括下列工艺步骤：

A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；

B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子；

C、将B步骤中制备的二级种子转接于三级扩大培养液：以5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物；

其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m³/h、搅拌转速为200-300r/min。

所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.2-7.6；培养条件为：温度为30-37℃、发酵时间为12-24h，转速为300r/min。

所述的A步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。

所述的B步骤中的二级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；

发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m³/h、搅拌转速为200-300r/min。

所述的C步骤中的三级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；