[发明专利]抑制手足口病病毒基因的干扰RNA, 包含其的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及针对引起手足口病的两种主要病原体肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因组的干扰RNA，包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰RNA及其在制备用于预防或治疗手足口病的药物中的应用。 

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由肠道病毒引起，临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区包括中国的多个省份均有此病流行的报导，已引起了全世界的普遍关注。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最常见，成为手足口病的主要病原体(Li et al.，2004)。由于目前尚无公认的十分有效的针对手足口病主要病毒肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的疫苗，因此研发能有效地针对手足口病的预防或治疗手段是十分急迫的。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种序列特异的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子，在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默。随着研究的进展，发现这一现象具有重要的生物学功能，如RNA干扰可产生类似于基因敲除的表型，使其作为一种工具，对基因的功能进行研究；并且越来越多的文献报道RNA干扰可以用来作为清除病毒的一种手段，以此作为基因治疗的方式。例如人类免疫缺陷病毒、乙肝病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒等(Gao et al.，2006；Gitlin et al.，2002；Haasnoot et al.，2007；Liu et al.，2007；Ying et al.，2007)。 

本发明的发明人设计了针对引起手足口病的两种主要病原体肠道病 毒71型和柯萨奇病毒A16基因组的干扰RNA序列，并将其编码DNA序列构建到小环DNA载体中，申请人的实验结果证明，本发明设计的干扰RNA序列以及包含其的载体可以同时有效地抑制肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的表达，从而显著抑制了病毒的复制水平。本发明的小环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构，从而减少了未甲基化的CpG所致的炎性反应，提高了安全性；而碱基数的减小，更有效的提高了目的基因的表达和生物利用度。小环DNA载体克服了传统质粒载体转染率低、易引起免疫反应及外源基因在体内表达时间短的缺点，是一种安全、高效的新型载体。因此所构建的小环DNA载体转录的干扰RNA不仅相比于化学合成的干扰RNA靶向性更好，特异性更强，具有更好的稳定性，能够克服化学合成干扰RNA的不稳定，药物作用持续时间短，吸收量少的特点，而且相比于病毒载体具有更好的安全性，作用效果稳定，药物作用持续时间长，可以多次免疫的优点。 

参考文献 

[1]Li，L.，He，Y.，Yang，H.，Zhu，J.，Xu，X.，Dong，J.，Zhu，Y.，Jin，Q.，2005.Genetic characteristics of human Enterovirus 71 and coxsackievirus A16circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China.J.Clin.Microbiol.43，3835-3839. 

[2]Gao，Y.，Sun，L.，Dong，J.，Xu，X.，Shu，Y.，Chen，M.，Yin，L.，Liang，Z.，Jin，Q.，2006.Rapid identification of small interfering RNA that caneffectively inhibit the replication of multiple influenza B virus strains.Antiviral Ther.11，431-438. 

[3]Gitlin，L.，Karelsky，S.，Andino，R.，2002.Short interfering RNA confersintracellular antiviral immunity in human cells.Nature 418，430-434.