[发明专利]一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌及其应用，具体地说，本发明涉及一株主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，应用于抗生素制造。

背景技术

黑暗链霉菌（Streptomyces tenebrarius）是1967年美国礼莱公司研究人员从土壤中分离得到，该菌株能产生一组抗生素，称之为暗霉素复合物（Nebramycins），组分2（图1；阿伯拉霉素）、4（图2；氨甲酰卡那霉素B）、5’（图2；氨甲酰妥布霉素）为主组分，在对各个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料药。多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究，主要集中在传统常规诱变育种、基因工程育种和优化生产工艺等各方面，并取得了一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，并融入到了抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面的研究，也取得不少进展。 

妥布霉素是一种广谱高效抗生素，在体外对多种病原菌有抗菌活性，特别是那些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效，而且妥布霉素的耳、肾毒性相对较低，是临床上广泛应用的抗菌药。目前，妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中经层析分离，去除阿伯拉霉素和卡那霉素B后，得到氨甲酰妥布霉素，再在碱性条件下，高温水解制备妥布霉素。由于阿伯拉霉素和卡那霉素B的结构和理化性质与氨甲酰妥布霉素相近，因此，在工业化生产中，要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离，十分困难。不但层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，工艺复杂，而且产品质量不稳定，因此，长期困扰企业生产，阻碍了企业产品生产技术的升级换代，成了产业化生产的技术瓶颈，结果是生产成本高，环境污染严重，价格居高不下。

若能获得主产氨甲酰妥布霉素的稳定菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的直接经济效益，间接社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。

发明内容

    本发明的目的在于提供一株不合成阿伯拉霉素，主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，用于制备硫酸妥布霉素。

该工程菌为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius) HM106（△aprHM）菌株，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 5246。      

本发明还提供了菌株HM106（△aprHM）的发酵方法，具体步骤如下：发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养5天，挖块接种于种子培养基，37℃摇床培养18 h，转速为180-350rpm；然后按10%接种量转接于发酵培养基，37℃摇床培养120 h，转速为250rpm；所述种子培养基：葡萄糖1-5g，玉米淀粉10-20g，黄豆饼粉5-30g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，氯化钾1-5g，氯化钙0.5-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，加自来水至1L，发酵培养基：葡萄糖10-30g，玉米粉10-30g，黄豆饼粉10-30g，硫酸镁1.0-11g，碳酸钙1-7g，硫酸锌0.1-0.5g，硫酸铵1-7g，玉米淀粉10-50g，淀粉酶0.01-0.50g，加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0-7.2。

所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。

菌株GK1101的筛选，主要包括以下几个步骤： 

A.      aprH-M基因置换质粒的构建；

B.      置换质粒转化黑暗链霉菌；

C.      转化子的筛选；

D.     工程菌组分的鉴定。

    基因置换的方法是，采用PCR法分别获得aprH-M基因上下游长度约2000bp的片段，作为同源交换臂，将两者同时连接到穿梭载体上，如pKC1139等，在两个交换臂之间插入四环素抗性基因tet^r，作为密码标记，交换臂外插入红霉素抗性等基因，如ermE，作为筛选标记，便于黑暗链霉菌DNA重组后工程菌的筛选，最终得到 pHM106。