[发明专利]一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶基因缺失株、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶基因缺失株、其构建方法及应用，属于细菌基因工程技术领域。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。目前该病已在世界各国广泛流行，造成巨大的经济损失，成为国际公认的危害现代化养猪业的重要传染病之一。随着我国现代养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，有的猪场的阳性率已达到70％以上，严重阻碍了我国养猪业的健康发展。

根据APP表面荚膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可将APP分为15个血清型，血清1型又分为1a和1b两个亚型，血清5型又分为5a和5b两个亚型。目前在我国已发现并分离到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型，主要流行的血清型为1、3、5和7型。

生物被膜(Biofilm)是在生物体内和非生物体表面集聚生长的由细菌及其产生的多糖蛋白复合物所形成的固定细菌群落，它是病原菌持续感染、产生耐药性和免疫逃逸的重要原因之一。APP长期潜伏于猪体内常常引起持续性感染，近年来获得的许多临床分离株具有多重耐药性，并且较普遍地能形成生物被膜，被认为在APP致病过程中发挥重要作用。

生物被膜的产生是一个高度复杂的、由多种基因调控的动态过程，这些基因涉及到细菌的黏附、新陈代谢、群体感应(quorum sensing)和应激反应(stress response)等。近年来对病原菌应激反应与感染性疾病的研究发现，ClpP蛋白酶这一应激蛋白是一种十分重要的毒力因子，它是ATP依赖的丝氨酸蛋白酶，调节着细菌对环境各种压力的适应(如热休克、营养缺限、氧化应激等)，维持细菌的形态和毒力，使其在各种环境下得到保护。研究发现该基因的插入突变或缺失通常会降低细菌对不良因素的承受能力，菌体生长被破坏，存活力下降，并影响生物被膜形成，造成毒力减弱。目前虽然仅探索了少数病原菌ClpP蛋白酶的功能，但在揭示致病机理和疫苗研究中已经显示出极为重要的研究价值和疫苗应用前景。

鉴于上述背景，构建在我国流行的APP血清7型ClpP蛋白酶基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、毒力、对动物的致病性和免疫原性等生物学特性，为猪传染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道传染病的药物研究以及疫苗研究奠定重要的基础。

发明内容

本发明的目的在于获得一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株。

本发明提供的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株，是将猪胸膜肺炎放线杆菌的ClpP蛋白酶的编码基因灭活后得到的缺失株。

本发明的目的之二在于提供一种制备所述不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株的方法，其特征在于疫苗株是通过将DNA片段ΔclpP导入所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株经同源重组实现的；所述DNA片段ΔclpP从上游至下游依次为同源臂ClpPS和同源臂ClpPX：所述同源臂ClpPS和同源臂ClpPX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的ClpP蛋白酶编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述ClpP蛋白酶的编码基因。

在本发明的一个具体实施例中，所述ClpP蛋白酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个具体实施例中，扩增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示：

clpSF：5’-CG(EcoR I)GGGGCGTTACTGGATGC-3’

clpSR：5’-CCATCGCTTCGGTTTGC-3’

扩增下同源臂ClpPX的引物序列如下所示：

clpXF：5’-TCCAAAGGCGAATACGGTC-3’

clpXR：5’-CG(BamH I)TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3’。

本发明的目的之三在于提供所述的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株在制备猪传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分为本发明所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株。

本发明是通过以下技术方案来实现的：