[发明专利]表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-mep及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程疫苗领域，涉及表达乙型脑炎病毒E蛋白多表位抗原的重组痘病毒rMVA-mep及其应用。

背景技术

日本脑炎病毒(简称乙脑)属于黄病毒科黄病毒属，是一种以蚊虫为媒介传播的人畜共患的病毒性疾病。对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。

目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗，但是有关它们的安全性、生产和使用费用等问题越来越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗，乙脑病毒的E蛋白与病毒和细胞受体结合、膜融合有关，也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。

表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)。它是T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)与抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别被称为T细胞表位和B细胞表位。作为理想的免疫原，抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，才能诱导出高度特异性的体液及细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，赋予较广泛的保护性。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展，因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。

E蛋白表位研究：

Takada K等(2002)通过JEV E蛋白在小鼠体内特异性的CD8⁺CTLs反应，证明⁶⁰CYHASVTDI⁶⁸是E蛋白上主要的CTL表位。

Lin等(2004)应用噬菌体展示肽库鉴定了JEV囊膜蛋白的模拟表位，同单抗2H2结合的模拟表位拥有一个保守的基序X(1)(D/E)(Y/T/S)X(2)，该基序位于E蛋白区域III的外侧表面。

闫丽萍等(2007)用融合蛋白进行免疫学反应性扫描，鉴定出了9个E蛋白线性抗原表位：E1(1-16)、E10-4(77-84)、E11-2(83-94)、E19(145-164)、E33(257-272)、E39-2(309-316)、E45-3(359-362)、E48-1(377-384)、E49(385-400)。

多表位疫苗(multi-epitope vaccine)也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制备的，是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路，代表了一种疫苗设计的新方向，对它的研究是基因工程疫苗研究领域里的热点之一。与传统疫苗相比，多表位疫苗有很多优势：能被具有多种遗传背景的MHC分子识别、结合，从而得到高效的递呈；在细胞免疫方面具有独特的优势，可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。

抗原表位的选择

为了使机体获得最佳的免疫保护，需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性，有针对性的选择目的表位。体液免疫和细胞免疫共同构成了机体的免疫应答系统。体液免疫主要是通过B细胞产生的抗体来发挥作用的，故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD4+辅助性T细胞(分为Th1与Th2两个亚群)应答和CD8+细胞毒性T细胞应答，因此可根据机体对病原体的免疫应答特点，选择特异性的Th1表位、Th2表位或CTL表位诱导机体免疫应答向Th1、Th2或CTL应答类型定向发展。

考虑到多表位疫苗的保护范围，可将目标抗原上的多个B细胞表位和外源性(或内源性)T细胞表位同时考虑进来，以诱导特异的体液和细胞免疫，从体液和细胞免疫水平发挥预防控制作用，这种设计可以拓宽多表位疫苗的保护谱。若选择的表位来自抗原分子的保守氨基酸区域，则可提供不同毒株之间的交叉免疫保护，可有效应对宿主自身基因的高频突变所造成的免疫逃避问题。据此构建具有交叉保护作用的可准确到达靶标的复合型多表位疫苗，可能是预防具有多血清型及高突变率病毒(如禽流感病毒)感染的有效途径。

病毒表达系统：