[发明专利]MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒剂QacA基因携带情况的检测引物及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌的qac 转运系统属于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS) ，由QacA 和qacR 基因构成，由质粒编码，QacA 是多药转运蛋白，因介导对亲脂性消毒剂季胺类化合物(quaternary ammonium compounds，Qac) 外排而命名；QacR 是188 个氨基酸的多药结合蛋白，属TerR 类转录抑制蛋白。无诱导底物时，QacR 结合在QacA 启动子下游的假回文序列( IR1) 上，抑制QacA 的转录。因为该假回文序列(IR1) 与转录起始位点重叠， 所以推测QacR 通过结合IR1结构而阻止RNA 聚合酶2启动子复合体形成有效的转录状态而抑制QacA 的转录，并不是通过阻止RNA 聚合酶的结合。QacA基因表达多种化合物外排泵蛋白，细菌获得QacA基因可表现为对胺类(如苯扎溴铵) 、胍类(如氯己定) 、腙类消毒剂耐药，由此在医学领域带来了极大的危险因素。

目前检测QacA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。

发明内容

本发明的目的是提供耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒剂QacA基因携带情况的PCR检测引物及检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MRSA中QacA基因携带情况的检测引物，其特征在于，包括：

QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。

本发明还提供了一种MRSA中QacA基因携带情况的检测方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacA基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacA序列，构建携带QacA基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5～15umol/L 的QacA基因正向引物溶液，浓度为5～15umol/L 的QacA基因反向引物溶液以及浓度为5～15umol/L 的QacA基因检测探针溶液，其中，引物和探针序列如下：

 QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′；

QacA基因探针：FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ；

    第三步：在每一个PCR反应孔中加入PCR Master Mix 10～15ul，第二步所得的QacA基因正向引物溶液0.1～1ul，QacA基因反向引物溶液0.1～1ul，QacA基因检测探针溶液0.1～1ul，第一步所得的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0.1～1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40～60℃保温1～3分钟，80～100℃保温1～3分钟，再运行30～50个循环，每个循环包括在80～100℃保温10～20秒再在50～70℃保温0.5～1.5分钟；

    第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacA基因。

本发明是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中是否还有耐消毒剂QacA基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中QacA基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。

本发明检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。

附图说明