[发明专利]一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微藻基因工程领域，更具体涉及一种微藻启动子克隆T载体的构建方法，同时还涉及一种微藻启动子克隆T载体的用途，可用于微藻启动子的直接克隆并在莱茵衣藻中分析该启动子的功能，该方法可快速克隆微藻启动子并进行功能分析。 

背景技术

启动子是基因调控中普遍存在的顺式作用元件，是RNA聚合酶能够识别并与之结合而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因5′端上游。它能决定转录的方向和效率，以及RNA聚合酶类型，并引导RNA聚合酶与模板的正确结合。因此，启动子的功能序列对于基因的表达调控机制的研究具有十分重要的意义。研究启动子功能的手段之一就是通过基因工程手段。它是分子生物实验的基本技术之一，即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA分子中形成重组DNA分子，然后将该重组载体转运到宿主细胞中，随着宿主细胞的繁殖载体进行复制，在这一系列过程中与载体相连的外源基因片段同时被克隆。传统的克隆方法是：限制性酶切目的片段后再连接到载体的相应位点上，该方法存在效率低、耗时长等缺点。于是研究人员又开发出了T载体，它是一种很方便的克隆载体，因其末端带有突出的T碱基，可直接与Taq酶扩增产物末端突出A碱基配对，大大提高了PCR产物与载体的连接效率。它是一种方便、高效的克隆载体，进行大量的克隆工作时，现实、简便的做法是使用商业化的T载体，常用的T载体包括pMD-18T、pGEM-T和pCF-T等。常见的T载体制备包括：首先是通过酶切得到平末端，然后在末端连入T碱基，此方法需要消耗大量的载体和酶，成本高，耗时长。通过分子生物学操作在载体两段引入Eam1105I等限制性内切酶位点，通过酶切直接获得T载体，此方法更高效、简便。 

藻类是含有光合色素，营自养生活，没有根茎叶分化的低等孢子植物类群，对藻类基因启动子的研究是从1990年代初对聚球藻的研究开始的。它的研究相对高等植物落后很多，水稻、烟草和拟南芥等高等植物的启动子已经做了很多的研究，它们已经建立了稳定的遗传转化体系，可以购买到各种克隆载体、转化载体、报告蛋白和抗体等，其他高等植物的启动子也可以在拟南芥、烟草等模式生物中进行功能研究。然而，藻类基因表达调控的研究就相对较少，主要集中于藻类光合作用与固氮作用相关基因的启动子，真核微藻主要集中在小球藻和莱茵衣藻上。微藻的调控机制与高等植物差别很大，因此研究人员无法利用烟草、拟南芥等成熟的模式生物对其启动子功能进行研究。这大大妨碍了微藻的相关研究，尤其是某些重要基因的调控机理研究。其他如雨生红球藻、硅藻和拟微绿球藻等经济微藻由于研究历史较短，目前还没有成熟的载体和表达系统对其启动子功能进行研究，因此，微藻启动子功能研究存在的主要问题有以下几方面： 

(1)目前还没有商业化的微藻克隆载体、表达载体或报告载体，大大阻碍了研究工作的开展； 

(2)许多微藻包括雨生红球藻等还没能建立遗传转化体系，不能通过基因工程手段对其功能基因进行研究，也不可能对其启动子的调控功能进行研究； 

莱茵衣藻是目前研究最多、技术最成熟的微藻，它是单细胞、带鞭毛的真核生物，隶属于绿藻门，团藻目，衣藻属.衣藻的结构简单，原生质膜紧贴着细胞壁，顶端长有两根鞭毛，侧面具有一个眼点，多数细胞还有一个或多个液泡，一个占细胞总体积近40％的大型杯状叶绿体。衣藻因其培养条件简单；生长周期短；生长迅速；光合效率高而具有“光合酵母”之称.其生物学特性为在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代，并进行遗传学分析提供了便利条件。它也是少数三套基因组均能进行遗传转化的植物之一。长期以来，莱茵衣藻由 于其自身的特点，一直被用作遗传研究的材料。广泛用于研究鞭毛结构和鞭毛组装，趋光性和生理节律，配子发生和交配和光合作用原理，叶绿体发育的分子生物学过程等，这些研究加深了我们对衣藻生理功能和遗传学的认识。它还有一个很大的优势，它作为微藻的模式生物进行了全基因组测序，这些研究和基因组数据使得衣藻的遗传学背景很清晰。所以，莱茵衣藻非常适合作为研究微藻的模式生物，包括功基因功能的研究，还可以用于研究微藻启动子的调控机理。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种微藻启动子的T载体的制备方法，该方法通过简单的PCR等分子生物学操作就可构建T载体，对操作人员要求不高，本发明详细提供了各步操作以及引物，技术成熟可靠，操作人员遵循该法即可得到T载体。可以利用该载体快速克隆微藻启动子，并在莱茵衣藻中进行启动子功能的验证，成为微藻基因工程研究人员的有利工具。