[发明专利]用于检测小鼠汉坦病毒的引物、探针及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR引物、探针及其试剂盒。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中鼠源RNA病毒有6种，分别为小鼠肺炎病毒(Pneumonia Virus of Mice，PVM)、汉坦病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic Choriomeningitis Virus，LCMV)、呼肠孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)、仙台病毒(Sendai virus，SEV)、小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，简称MuLV或MLV)，这些病毒属于一类或二类，为人畜共患病毒或对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

其中，汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因级为单负链RNA，分3个节断，由核衣壳包绕，有包膜。病毒增殖时，以负链RNA为模板产生正链RNA和mRNA，由正链RNA复制子代病毒基因级，出芽释放获得包膜。基因组包括L、M、S3个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒包括引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)、汉城病毒(Seoul virus，SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus，PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus，DOBV)及引起汉坦病毒肺综合征(HPS)的无名病毒(Sin Nombre virus，SNV)、纽约病毒(New York virus，NYV)等。

在国内常见的是肾综合征出血热(HFRS)，引起肾综合征出血热的汉坦病毒包括汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)和普马拉病毒(PUUV)，分别引起重度，中度和轻度的临床症状。肾综合征出血热具有明显的地区性和季节性，以10～12月份为多见，与鼠类的分布与活动有关。携带病毒的鼠(如黑线姬鼠)，通过唾液、尿、粪污染环境。人经呼吸道、消化道或直接接触等方式被传染。病毒导致全身毛细血管内皮细胞和小血管损伤，引起高热、出血、肾脏损害和免疫功能紊乱等临床表现。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光PCR技术(Real-time Fluorence Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定性定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定性定量分析。