[发明专利]用于检测小鼠肺炎病毒的引物、探针及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠肺炎病毒的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠肺炎病毒属于II类，目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

小鼠肺炎病毒(Pneumonia Virus of Mice，PVM)与人和牛呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)同属于肺炎病毒属肺炎病毒亚科副粘液病毒科，最早从健康的实验小鼠分离而得(Horsfall and Hahn，1939；1940)。该病毒能感染多种啮齿类动物(Eaton and Van Herick，1944；Horsfall and Curren，1946)，以潜伏或者不明显的方式广泛感染实验小鼠(Chambers et al.，1980；Parker et al.，1966)。最初的电镜分析发现小鼠肺炎病毒颗粒外观上和RS virus相似(Compans et al.，1967)，后来用RS virus病人的抗体进行分析，显示小鼠肺炎病毒的核蛋白与RS virus相应部位有交叉反应，但是没有交叉中和反应(Gimenez et al.，1984)。同样，PVM的单抗对RS virus磷蛋白也有交叉反应(Ling.and Pringle，1989)。

PVM是一种负链ssRNA病毒，无包膜，无分节，全长大约15kb。与RS virus在多种蛋白区同源性都比较高(Chambers et al.，1990)，但在非结构蛋白区(NSI，NS2)几乎没有同源性。

目前已知PVM有两个毒株：15和J3666。毒株15是最早由Horsfall和Hahn分离而得，是ATCC(the American Type Culture Collection)唯一备存的PVM毒株。毒株15无致病性，而另一毒株J3666则有强致病性。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。