[发明专利]一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，属于兽用疫苗领域。 

背景技术

猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)为冠状病毒科、冠状病毒属的成员。TGEV可感染所有年龄的猪，尤其是引起两周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率，是目前在世界范围内广泛存在的一种猪高度接触性烈性肠道传染病，常常在猪场反复发生和流行，给养猪业带来极大危害(Pensaert M B.Disease of Swine.Seventh edition.Iowa State University Press.USA.1992，305-338)。在众多学者的研究及临床探讨中发现用药物对猪传染性胃肠炎效果并不十分明，能够控制该病的关键是采用疫苗的预防，因此国内外学者对该病疫苗方面进行了大量的研究，目前国内还在广泛延用灭活苗、弱毒苗或基因工程苗，然而关于疫苗生产工艺方面还存在着许多需要改进的地方。 

目前国内兽用细胞疫苗的生产基本采用方瓶和滚瓶技术，这些技术在规模化生产病毒时劳动强度大、需要厂房面积大、生产出的抗原批间差异大，对标准化生产的质量控制很难操作。目前我国兽用疫苗市场中由于批间差异问题和病毒效价不高引起的质量不稳定的问题时有发生。在细胞疫苗生产行业中大规模生产动物细胞和病毒是疫苗产业化生产的前提。提高病毒效价和产量，是提升疫苗产业化生产工艺的必由之路。 

目前，国内采用的转瓶生产工艺得到的TGEV的病毒效价在10^7.0TCID50/ml左右，还没有解决猪传染性胃肠炎疫苗研究过程中存在的猪传染性胃肠炎病毒效价低和病毒产量难以放大的问题。 

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种工艺合理、病毒产量和效价高的猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，它既能解决传统的转瓶培养模式在病毒生产中存在的病毒产量低，病毒滴度不高，批间差异大的缺点，又能实现病毒的连续生产，并通过优化参数实现了高滴度多次收获病毒液，大大提高了病毒的产量。 

技术方案 

一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法，包括如下步骤： 

1)在潮汐式生物反应器中，接种制苗用细胞至生物反应器内的微载体上，进行细胞的吸附培养； 

2)在细胞的吸附培养结束后进行细胞的扩增培养； 

3)将猪传染性胃肠炎病毒接种到扩增培养的接种制苗用细胞上，进行病毒的吸附培养； 

4)在病毒的吸附培养结束后进行病毒的增殖培养； 

5)在接种制苗用细胞CPE达到70％以上时，收获病毒液。 

优选地，本发明所述微载体由选自聚酯、明胶或多糖的一种或几种制成。 

优选地，本发明所述微载体的添加量为5.5～10g/L。 

优选地，本发明在步骤1)中以2.0×10⁷～3.6×10⁷cells/g载体的细胞密度接种细胞。 

更优选地，本发明在步骤1)中以3.0×10⁷载体的细胞密度接种细胞。 

优选地，本发明在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.0×10⁸～4.5×10⁸cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。 

更优选地，本发明在步骤2)中的细胞扩增培养达到3.5×10⁸cells/g载体的细胞密度时进行步骤3)所述的病毒接种。 

优选地，本发明步骤3)中所述猪传染性胃肠炎病病毒接种的感染复数为0.01～0.1。 

优选地，本发明步骤1)中所述的吸附培养和步骤2)中所述的扩 增培养使用DMEM细胞培养液；步骤3)中所述的病毒吸附培养和步骤4)中所述的病毒增殖培养使用1.5％(V/V)牛血清的DMEM细胞培养液，其中所述的牛血清为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。 

优选地，本发明在步骤1)-步骤4)中载体罐中生长液的液面上下行速度均为0.5～50L/分钟，液面在载体上下端点停滞时间为0～150s，培养程序运行1～24h。