[发明专利]一种选育高产WF16616的寄生弯颈霉突变株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种选育高产WF16616的寄生弯颈霉突变株的方法。

背景技术

WF16616(FR190293)是1998年从真菌寄生弯颈霉(Tolypocladium parasiticum No.16616)的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类物质，其分子式为C₅₁H₈₂N₈O₂₁S，经过结构修饰改造可以得到一种新型棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净(Micafungin，MFG，FK-463)。WF16616(FR190293)及FK463结构式如下：

WF16616(FR190293)结构式

FK-463结构式

米卡芬净对念珠菌属、曲菌属具有广泛抗真菌作用，对耐氟康唑与依曲康唑的念珠菌亦有作用；能够非竞争性抑制1，3-β-D葡聚糖合成酶的活性，从而抑制真菌细胞壁合成，故该化合物对真菌细胞具有较高的特异性，对人体副作用较小。

米卡芬净由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungard，2005年3月通过美国FDA认证。目前本品主要获准用于治疗以目前的治疗手段难以治愈的真菌感染以及预防造血干细胞移植患者的真菌感染。

专利US005854276A和Ryuichi Kanasaki et al.J.Antibiot.59(3)：158-167，2006公布了利用真菌Tolypocladium parasiticum No.16616发酵生产WF 16616的过程，25℃培养6天后，所得15L发酵液经分离纯化后得到纯品46.6mg，约3.1mg/L，说明WF16616产量非常低。虽然目前通过发酵培养基的改进和发酵条件的优化能够使WF16616产量有一定程度的提高，但离真正实现工业生产仍有一定的距离。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前的寄生弯颈霉WF16616产量非常低的不足，提供一种选育生产WF16616的寄生弯颈霉突变菌株的方法。采用本发明的方法具有突变和筛选的方向性以及选择的高效性，所得突变株的菌落颜色由野生型的白色变为绿色，发酵产物WF16616的产量高，效价高。

本发明的技术方案如下：一种选育生产WF16616的寄生弯颈霉突变菌株的方法，包括以下步骤：

1)将野生型寄生弯颈霉(Tolypocladium parasiticum)的单孢子悬浮液进行紫外诱变，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布在固体平板上倒置培养至长出菌落，随机挑取单个菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，从中筛选出产量较高的突变株；

2)将步骤1)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行NTG(二硝基胍)诱变，即在单孢子悬浮液中加入NTG反应，然后涂布在固体平板上倒置培养至长出菌落，挑取菌落颜色形态变化较大的菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，筛选出产量较高的突变株；

3)将步骤2)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行紫外线和NaCl复合筛选，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布到含有NaCl的固体平板上倒置培养至长出菌落，选取菌落直径中等的菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，筛选出产量较高的突变株；

4)将步骤3)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行紫外线和发酵产物WF16616复合筛选，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布到含有发酵产物WF16616的固体平板上倒置培养至长出菌落，随机挑取单个菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，从中筛选出产量较高的突变株。

本发明步骤1)所述白色野生型寄生弯颈霉是出发菌株，优选ATCC52203。所述平板可以是常规，较优的为PDA平板。所述紫外诱变较佳的紫外线处理时间为90s～210s，优选120s-180s，最优为150s。

步骤2)所述的NTG(二硝基胍)加入到单孢子悬浮液后，反应终浓度较佳为1mg/ml。反应时间优选20～80min，最优为40min。然后用无菌水稀释终止反应。所述菌落形态变化主要为疏松和紧密型2种，较优的为紧密型突变株。所述PDA平板上菌落颜色为纯白、棕红以及绿色3种，最优为绿色突变株。原来的野生出发菌的菌落颜色为灰白。