[发明专利]人脐带华通氏胶组织块冻存保护液

说明书

技术领域

本发明涉及人脐带华通氏胶组织块的冻存保护液。

背景技术

人脐带华通氏胶(Wharton's Jelly)内的细胞具有能自我更新和多向分化、增殖能力强等干细胞的特征，我们称之为脐带间充质干细胞（huMSCs）。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以为将来不时之需。冻存保护液的配方及冻存的操作方案直接影响储存的脐带华通氏胶中间充质干细胞的质量，对将来的细胞移植效果至关重要。细胞或者组织的冷冻保存有几个关键性的环节：冷冻保护剂的选择和组合，各种冷冻保护剂的配比，冻存的步骤，冻存温度及复苏温度。

目前，脐带间充质干细胞的冻存方法多采用传统的细胞冷冻方法，细胞冷冻主要采用含有渗透性冷冻保护剂的冻存保护液，作用是降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻冷冻过程中细胞的损伤。通常情况下，人们选择单一的渗透性冷冻保护剂二甲基亚砜冻存干细胞，冻存后复苏后会有冻存保护液的残留，临床使用残留冻存保护液二甲基亚砜的干细胞，有较高的毒副作用，易造成恶心、呕吐、腹痛等不良反应。

发明内容

本发明的目的是采用由基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂组成的直接对人脐带华通氏胶组织块进行冷冻的冻存保护液，冻存效果好，细胞损伤少，冻存保护液残留低，毒副作用小，临床使用时对人体无伤害。

为了达到上述目的，本发明的脐带华通氏胶组织块冻存保护液，1L冻存保护液包括渗透性冷冻保护剂1-1.4 mol、非渗透性冷冻保护剂0.1-0.5mol,余量为基础液，其中

所述基础液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12、自体脐血血清、Invitrogen公司STEMPRO^? MSC SFM培养液、Stem Cell 公司MesenCult^?-XF Medium培养液中的一种或几种的组合；

所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种的组合；

所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。

与现有技术相比，本发明的冻存保护液冻存的是包含间充质干细胞的脐带华通氏胶组织块，冻存保护液配方既不是冻存干细胞的含单一冷冻保护剂的冻存保护液，也不是冻存组织块含高浓度冷冻保护剂的玻璃化冻存保护液，而是采用由较低浓度的渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂、基础液组成的冻存保护液。该冻存保护液中采用了包含培养液DMEM/F12、含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12、自体脐血血清、磷酸盐缓冲液PBS等的基础液，能够保证细胞内外的渗透平衡，尤其是采用了源于同一个体的自体脐血血清作为基础液为组织块提供养分，自体脐血血清简单易得，临床容易实现，没有外源成分的加入，最大限度保证了冻存过程中组织块内细胞的环境与体内环境一致，冻存效果好；采用了包含二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油等的渗透性冷冻保护剂，可以透过细胞膜渗透到细胞内，减少冷冻时细胞内冰晶的形成，且浓度都处在较低的水平上，最大限度的降低了对细胞的毒性；采用了包含蔗糖、甘露醇、海藻糖等的非渗透性冷冻保护剂，分子量大，很少的一部分就能大大增加溶液的粘度，缓解细胞冻存时细胞膜内外的渗透压，使细胞脱水，减少冷冻时细胞的冰晶形成，且对组织块内的干细胞无毒性。

[0007] 本发明采用对人脐带华通氏胶组织块直接冻存的保护液，同时考虑了在组织块复苏后降低冻存保护液残留对细胞的毒性，保证组织块冻存复苏后培养出的细胞的质量，能为临床上提供较高质量的脐带间充质干细胞。

附图说明     

图1为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的P0代人脐带间充质干细胞生长状态图；

图2为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的P1代人脐带间充质干细胞的成脂诱导鉴定图；     

图3为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的P1代人脐带间充质干细胞的成骨诱导鉴定图。 

具体实施方式 

通过以下实施例对本发明详细说明，但本发明的保护范围不局限于实施例列出的范围。  

实例一：