[发明专利]一种检测鱼类致病菌的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测鱼类致病菌的试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)于1979年首次作为斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)养殖的一种新的致病菌被报道，近年从斑点叉尾鮰病鱼诊断分离得到的细菌85％是鮰爱德华氏菌。

检测鮰爱德华氏菌的传统方法是细菌的常规分离鉴定，但所需时间长，程序繁琐，准确度较低。近年来，用PCR检测诊断的疾病的方法正在兴起。梁万文，“斑点叉尾鮰败血症PCR诊断方法的建立”，大连水产学院学报，2007年8月第22卷第4期公开了一种用PCR方法检测斑点叉尾鮰败血症的方法，但该方法的检测靶标是一种有待验证的基因(Edwardsiella ictaluri putative protein，eip)，其是否为致病性基因也有待进一步探讨，不具有代表性，且该文献检测对象为广西研究所鱼病研究室从叉尾鮰上分离鉴定并保存的，不是标准菌株，不能说明该文献的方法能准确检测鮰爱德华氏菌。

亟需寻找一种能准确检测鮰爱德华氏菌的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的试剂盒。

本发明提供了一种检测鱼类致病菌的试剂盒，所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物，用以扩增鮰爱德华氏菌的基因。

本发明还提供一种检测鱼类致病菌的方法，它包括如下步骤：

(1)提取待检样本的基因组DNA；

(2)以前述基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.1～2所示的引物扩增；

(3)对扩增结果进行检测。

所述步骤(1)中待检样本为鱼体或者养殖水体。

所述鱼体为肌肉、肝脏、鳃或者脾脏。

本发明最后提供了SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列在扩增或者检测来自鮰爱德华氏菌的基因的用途。

本发明提供的检测试剂盒和检测方法特异性强、灵敏度高，可以快速准确地判断鱼体或者水体是否被鮰爱德华氏菌污染，为斑点叉尾鮰的养殖提供保障。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1鮰爱德华氏菌常规PCR引物验证实验结果。1：DNA；2：单菌落；3：空白对照；M：DNA maker I，该maker有6条条带，从上至下分子量依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp。

图2鮰爱德华氏菌PCR检测体系的特异性检测结果。1：空白对照；2：荧光假单胞菌；3：河水弧菌；4：嗜水气单胞菌；5：豚鼠气单胞菌；6：温和气单胞菌；7：柱状黄杆菌；8：鮰爱德华氏菌；M：DNA marker I。

图3鮰爱德华氏菌PCR检测体系的灵敏度检测结果。1-8：梯度稀释的DNA模板，浓度依次为25ng/μL-2.5fg/μL；9：空白对照；M：DNA maker I。

图4鮰爱德华氏菌PCR检测体系的灵敏度检测结果。1-8：梯度稀释的菌液，浓度依次为0.28×10⁸cfu/mL-0.28×10¹cfu/mL；9：空白对照；M：DNAmaker I。

图5斑点叉尾鮰病原检测结果。M：DNA maker I；1：肌肉组织；2：肌肉组织；3：肝组织；4：肌肉组织；5：肌肉组织；6：肌肉组织；7：肌肉组织；8：肌肉组织；9：肌肉组织；10：空白对照；11：鱼鳃；12：鱼鳃；13：脾；14：血液；15：阳性对照。

具体实施方式

实验材料：

实验菌株：柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌，均购自中国科学院水生生物研究所，鮰爱德华氏菌ATCC33202，购自ATCC。