[发明专利]中华按蚊抗药性PCR-RFLP检测试剂盒及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中华按蚊抗药性PCR-RFLP检测试剂盒及其专用引物。

背景技术

中华按蚊(Anopheles sinensis)分布于我国除青海和新疆以外的所有省市，是我国平原水网和水稻种植地区的优势蚊种，家野两栖，白天多栖息在村庄四周的作物植棵和芦苇丛、灌木丛中，部分栖息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、马、猪等大牲畜为主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中华按蚊是我国疟疾的重要传播媒介，尤其在北纬34°以北的地区，它是主要的或唯一的传播媒介。目前，疟疾尚无有效疫苗可用，控制疟疾媒介的种群数量是防治疟疾的重要手段。化学防治因其易操作，能够迅速、有效地控制害虫种群，在媒介昆虫防制规划中占有重要地位。过去几十年来，针对中华按蚊的生活习性，用拟除虫菊酯类杀虫剂，采用滞留喷洒和浸泡蚊帐等灭蚊防疟措施，取得了显著效果。然而，化学防治在充分发挥其优势的同时，也带来了负面效果，导致了中华按蚊抗药性的产生。九十年代以来，国内各地报道的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性越来越明显。1993年重庆中华按蚊对溴氰菊酯和DDT达到初级抗性，1998年在云南采集的10个中华按蚊种群有5个对DDT产生抗性，1999年浙江温州、宁波等地的中华按蚊种群达到高抗种群(R/S＝15-20)，2009年，江苏部分地区的中华按蚊对溴氰菊酯产生了高度抗性。

害虫对杀虫剂产生抗性以后，化学防治的效果就会随着抗药性的升高而下降，害虫的防治也会受到严重的影响。为了应对害虫种群的抗性，为了克服抗性达到预期的防治效果，杀虫剂的使用量，包括单位面积的施药量和施药次数，就不得不持续增加，这无异于在持续增加杀虫剂对媒介昆虫抗性的选择压力，而且这种抗药性还可向远距离扩散，间接地还可能造成某些媒介疾病的发生与流行。从这些年对害虫抗药性的监测来看，抗药性增长的速度远大于新农药、新剂型研发的速度。因此，如何加强媒介昆虫的抗药性治理、延缓抗药性的产生和发展、延长现有杀虫剂的使用寿命是害虫治理中的重要内容。

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性主要是击倒抗性(knockdown resistance，kdr)，kdr基因在中华按蚊对拟除虫菊酯的抗性中具有重要作用。拟除虫菊酯的作用靶标主要是昆虫电压依赖性神经细胞膜上的钠离子通道，离子通道上的作用靶点对杀虫剂降低了敏感性而产生击倒抗性，因此击倒抗性不同于代谢抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制剂所降低。通过比较敏感、抗性中华按蚊的部分钠通道序列，发现para型钠通道基因(para基因是指整个钠通道基因，而KDR基因是指含有kdr位点的，即含有抗性位点的一段序列均为kdr基因)的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG→TTT的突变及L1014C(亮氨酸到半胱氨酸)即TTG-TGT的突变和击倒抗性相关。这是我国关于中华按蚊击倒抗性及其基因突变的首次报道。

kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。谭伟龙等(2011)用特异性等位基因PCR方法，对采江苏、安徽的11个中华按蚊种群进行致死中浓度(LC50)和kdr基因频率的测定，并且发现LC₅₀为代表的高效氯氰菊酯抗性与中华按蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为中华按蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。

目前我国还没有成型的针对中华按蚊的kdr抗性分子检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物。

本发明提供的专用引物，由引物组A和引物组B组成：

所述引物组A由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2；

所述引物组B由引物3和引物4组成，所述引物3和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4。所述引物组A和所述引物组B为独立包装；

所述突变位点为L1014F或L1014C。

本发明的第二个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂。

本发明提供的试剂，由试剂A和试剂B组成，所述试剂A由所述的专用引物中的引物组A和HindⅢ组成；所述试剂B由所述的专用引物中的引物组B和HphⅠ组成。

所述试剂A和所述试剂B均为独立包装；