[发明专利]分泌生产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物生物技术领域，涉及发酵产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，在医学和化妆品，食品加工，蛋白纯化等领域有着广泛的应用[Sies H.(1999)Free Rad Biol Med.27，916-921；Henry Jay Forman et，al，(2009)Molecular Aspects of Medicine 30，1-12；郑云朗(1995)生物学通报30，22-24；Castro，VM.et，al(1993)，Biochem J 292，371-377]。

自上世纪70年代日本协和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用发酵法生产谷胱甘肽工业化以后，发酵法生产GSH就成为其工业生产研究的主要方法[Sakato，K.and Tanaka H.1992，Biotechnol.Bioeng.40，904-912]。为此，上世纪七十年代后，各国开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利[Kimura A.(1986)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，33，1-51，Nanjo，H.，Yamashita，K.，et.，al(1986)公开特许公报61-52299；Tezuka，H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al(1987)公开特许公报62-275685；Christine，L.，Ulf，S.(1989)Eur.Pat.Appl.EP 300168；王绍校，(2005).中国学位论文全文数据库；饶志明等(2007).应用与环境生物学报，13：257-260；饶志明等(2007).食品与发酵工业.33：1-4；蔡宇杰等，食品与机械，23，16-19；US Patent 6902912；US Patent 4598046；US Patent 4582801；JP19890032584；WO2004/003217 A1；EP1539982；US Patent 20050239164，CN200810019761.6]。其中，发酵菌株的选育主要集中在酵母(如Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)和大肠杆菌等微生物，通常的方法是在育种中利用基因重组技术使微生物细胞表达GSH相关合成相关基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破转录调控，使细胞内GSH合成酶活增加，从而提高GSH产量。

谷胱甘肽作为细胞内重要的多功能因子，其合成与调控等机理复杂。

Alfafara等人研究表明，胞内半胱氨酸的浓度是GSH合成产量的限制因素[Alfafara et，al.1992，Appl.microbiol.biotechol.36，358-540]。发酵添加半胱氨酸可以直接提高GSH的产量[Wen，S.et，al.2004，Enzyme Microbial.tech.35，501-507]。

细胞内高浓度GSH对谷胱甘肽合成酶1(gsh1)的竞争抑制以及谷胱甘肽积累后胞内毒性是提高发酵法谷胱甘肽含量以及产业化最大瓶颈[P G Richman，et，al.1975，J.Biol.Chem.250：1422-1426；Srikanth，C.V.et，al.2005，Curr Genet.47，345-358]。

为了解决胞内GSH对gsh1合成酶的竞争抑制和GSH高浓度胞内毒性，李华钟等人构建了带有GSH I和GSH II基因的质粒转化后的大肠杆菌，通过发酵处理使得生产GSH分泌到细胞外，发酵产量高达7g/L[李华钟等(2001)微生物学报，41：16-23]。虽然他们构建的工程菌发酵生产GSH是目前报道最高的产量，但发酵过程还需要添加甲苯等有毒化合物，不利于工业化。2004年Perone G.G.等人通过表达gshI和gshII基因和突变相关基因使得酵母菌发酵生产GSH分泌到细胞外，但专利报道摇瓶产量仅为胞内0.06um/L，胞外0.03umol/L左右[WO2004/003217 A1]。

发明内容

本发明首先提供一种分泌生产谷胱甘肽的重组菌株。

本发明还提供所述重组菌株的制备方法。

本发明还提供所述重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

本发明提供的生产谷胱甘肽的重组菌株，其谷胱甘肽胞外向胞内运输蛋白基因失活，并且表达外源谷胱甘肽胞内向胞外运输蛋白基因。