[发明专利]肠炎沙门氏菌的链置换恒温扩增(SDA)快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及恒温扩增快速检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，其中肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)是重要致病的沙门氏菌之一。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠炎沙门氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其使用方法。

本发明的另一目的是提供一种肠炎沙门氏菌的快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

基于上述原理，本发明提供的肠炎沙门氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括：

(1)模板预处理反应液：1×NEB buffer 2、1.0μM上游内引物S1、1.0μM下游内引物S2、3％(V/V)二甲基亚砜、和ddH₂O。

所述1×NEB buffer 2为：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇，和ddH₂O，pH 7.9。

所述的引物S1和S2分别如SEQ ID NO：1和2所示。

(2)链置换扩增反应液I：3％(V/V)二甲基亚砜，0.1mg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为0.2mM dATP、dGTP和dTTP的混合液，1.0mM dCTPαS，1×NEB buffer 2，和ddH₂O。

(3)Bst DNA聚合酶；

(4)限制性内切酶BsoBI。

使用上述试剂盒检测肠炎沙门氏菌的方法，包括步骤：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取DNA，其中提取的DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。

(2)模板预处理程序：

取模板预处理反应液23μL，加入待检样品DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA扩增模板。

(3)SDA扩增：将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA聚合酶与0.4μL BsoBI，置于59℃水浴反应1h。

(4)核酸凝胶电泳检测：

反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现100bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。

本发明的试剂盒根据目标菌株的保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的链置换扩增技术(SDA)技术，特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特别适用于基层医疗机构及食品公司与相关检测部门。

附图说明

图1：其中，1检测样品 2肠炎沙门氏菌阳性对照 3 DNA Marker 4阴性对照

具体实施方式

SDA(Strand displacement amplification)反应是一种恒温、酶控的体外核酸扩增技术，主要依据限制性内切酶识别并切割半硫代磷酸化DNA的未修饰链以形成一个切口，在具有链置换能力的DNA聚合酶的作用下从切口处聚合延伸并取代下游DNA链。被置换下的单链DNA再与引物结合并由DNA聚合酶延伸成双链DNA。这种“切口一扩增一置换”不断循环往复达到靶序列高效扩增的目的。

基于上述原理，本发明提供的肠炎沙门氏菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括：

(1)模板预处理反应液(所列组分均为在模板预处理反应液中的终浓度)：包括1×NEB buffer 2，1.0μM上游内引物(S1)、1.0μM下游内引物(S2)、体积比3％DMSO(二甲基亚砜)、ddH₂O。