[发明专利]一种含胆固醇的无毒细胞冷冻液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞冷冻剂，属于生物学中的细胞保存领域。

背景技术

目前用于细胞的冻存，大都使用DMSO用来作为细胞的保护剂，DMSO中文名称二甲基亚砜，是一种含硫的有机化合物，分子式（CH3）₂SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体，具有高极性、高沸点，热稳定性好，与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，吸入高挥发浓度可导致头痛和晕眩，最为常见的症状为恶心、呕吐和皮疹，呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。

发明内容

因此，人们对无毒细胞冷冻液存在极大的需求，至今为止还没有发现关于本发明的有关报道，本发明人经过大量的研究试验，终于摸索研究出无毒的细胞保护冷冻液，从而完成了本发明。

本发明的目的就是提供一种具有保护细胞作用的无毒细胞冷冻液。

本发明的另一个目的就是提供该细胞冷冻液的制备方法。

本发明的方案是将CLC与被β-环糊精环包的胆固醇和EDTA作为细胞冷冻保护剂的主要成份，以替代DMSO，从而发挥对细胞保护作用。其中EDTA，中文化学名：乙二胺四乙酸，外观为白色结晶性粉末，为优良的络合剂，主要用于将硬水软化，可以有效螯合硬水中的多种金属离子，控制聚合反应速度，降低金属离子对细胞的毒害作用，在细胞所处的液体环境中即可对细胞进行保护。β-环糊精，为水溶性、非还原性的白色结晶粉末。系环糊精聚糖转位酶作用于淀粉后经水解环合而成的产物，呈筒状结构，其两端与外部为亲水性，而筒的内部为疏水性，借范德华力利用电性的吸引力将一些大小和形状合适的药物分子(如卤素、挥发油等)包含于环状结构中。本发明中其起包合作用。胆固醇，学名为5-胆烯-3-β-醇。在类固醇核的C-3上连接一羟基，而在C-17位上接有一条八碳或更多碳原子的脂族侧链。是由乙酰辅酶A通过异戊二烯单位的缩合反应而合成,可作为胆酸和类固醇激素的前体。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且在调节膜的流动性，增加膜的稳定性以及降低水溶性物质的通透性方面起着重要的作用。

具体实施方式

本发明是由下述试剂配制而成

CLC 200mg：自制结晶物。在细胞培养液中终浓度为2 mg/ml。

CLC（被β-环糊精环包的胆固醇）是一种自制结晶物：由下述物品制成：胆固醇200mg，β-环糊精1mg，氯仿1ml，甲醇2ml。具体制作过程如下：先将200mg胆固醇溶于1ml氯仿中，1mg β-环糊精溶于2ml甲醇中，混合均匀后，液体挥发得到结晶物。将此结晶物与EDTA按一定比例加入到细胞培养液中，便得到了新的细胞冷冻液。

EDTA 150mg：由上海沪宇生物试剂公司提供。在细胞培养液中终浓度为1.5mg/ml。

M199细胞培养液100ml：由上海吉诺生物科技有限公司提供。

本发明的配制方法：

1、先将100mlm199细胞培养液放入洁净的容器中；

2、再将自制的CLC 200 mg和EDTA 150 mg，溶解于100 mlm199细胞培养液中搅拌混合均匀，使CLC终浓度达到2mg/ml，EDTA终浓度达到1.5 mg /ml。

3、用0.2μm滤膜过滤除菌，即制成无毒细胞冷冻液。

本发明选料精确，配比合理，EDTA能够与金属离子形成配合物，而β-环糊精包被胆固醇后，解决了胆固醇不溶于培养液的矛盾，从而顺利与细胞膜结合，发挥对细胞膜的保护作用，下面结合对比实验进一步阐述本发明的效果。

对比实验的资料见下表：

    经多次重复实验表明，用本发明冷冻液将细胞冻存2个月，复苏后与添加10%的DMSO对照对比，能提高细胞的复苏率近10个百分点，且本发明冷冻液无毒，对人体无害，与常规的DMSO相比，有一定的应用和推广价值。