[发明专利]从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒及这种试剂盒的用途，确切讲本发明涉及一种用于检测犬粪是否存在房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)病原的检测试剂盒和该试剂盒的用途。 

背景技术

多房棘球绦虫的成虫主要寄生于犬、狼、狐狸等犬科动物的小肠中，虫卵随粪便排出体外，感染人和多种啮齿动物，并寄生于其肝脏等器官，引起泡型棘球蚴病。人的多房棘球蚴病危害严重，病死率极高，又称“虫癌”，严重威胁我国西部广大牧民的生命与健康。因此，建立一种快速有效的多房棘球绦虫感染犬粪DNA的检测试剂盒对预防、控制和治疗该病具有重要的意义。 

然而，已有的检测方法如常规的病原学检测法(槟榔碱导泻法和剖检法)、粪DNA-PCR检测法和粪抗原ELISA检测法(Dinkel A，et al.Detection of Echinococcus multilocularis in the definitive host：coprodiagnosis by PCR as an alternative to Necropsy[J].J Clin Microbiol，1998，36(7)：1871-1876.；Eckert J.Predictive values and quality control of techniques for the diagnosis of Echinococcus multilocularis in definitive hosts.Acta Trop，2003，85(2)：157-163.)都存在一定的缺点，敏感性和特异性都较低，其中常规检测法还具有感染人和周围环境的危险。 

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒，以及用这种试剂盒配制相应试剂的方法和检测方法。 

本发明的从犬粪中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒中包括有四个特异性引物，这四个特异引物分别是上游外部引物F3：5′-gTgTgTTgCTATATTgCTTgT-3′(SEQ №1)；下游外部引物B3：5′-AACTTTAACAACATACACCTAgT-3′(SEQ №2)；上游内部引物FIP：5′-TTAACCAACCAATAACAACCCAgTgAATTCgTggTgTTAgTTATTTggTTAgg-3 ′(SEQ №3)和下游内部引物BIP：5′-ATgTgACgTTTggTgTggTAgTTAgAATTCAAgAACCACCAAAATAATgTCT-3′(SEQ №4)。 

为方便使用，本发明的从犬粪中检测多房棘球绦虫的试剂盒中还可有LAMP反应液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板以及显色剂。 

利用本发明的试剂盒可配制用于检测犬粪便中多房棘球绦虫病原的试剂。 

本发明的从犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒的使用方法是从犬粪便中提取DNA，分别配制LAMP反应液和引物混合液，将所得到的犬粪便DNA与LAMP反应液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后进行LAMP扩增反应，在反应产物中入显色剂或对反应产物进行电泳，根据反应产物是否显色或在电泳中是否有梯度条带确定被检样品是否有多房棘球绦虫病原。 

本发明是一种新型的DNA扩增技术——环介导的恒温扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)。此方法比PCR更特异、敏感、快速、简单，且受粪DNA中PCR抑制因子影响较小，简单的仪器如恒温水浴锅即可完成反应。到目前为止，尚无应用此方法在犬粪便中检测多房棘球绦虫病原的报道。本发明为一种快速检测犬粪便中多房棘球绦虫病原体的方法，敏感性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，在普通的实验室就可进行；具有操作简单、敏感性高、特异性强、快速等特点，因此存在潜在的实验研究和极具潜力的临床应用价值。 

附图说明

图1A为本发明的LAMP扩增及显色结果，其中：1为阳性粪DNA，2为阴性对照。 

图1B为LAMP扩增及酶切电泳检测结果，其中：M为DNA标准分子量DL1000，1为标准阳性粪DNA，2为灭菌水空白对照。 

图2为临床样品的检测结果的电泳图，其中：M为DNA标准分子DL1000，1为标准阳性粪DNA；2～5分别为临床样品结果，6为阴性粪DNA，7为灭菌水空白对照。 

具体实施方式

以下结合实施例说明。