[发明专利]低甲基化基因F10的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及低甲基化基因F10在制备脑胶质瘤病人预后预测试剂中的应用。 

背景技术

表观遗传机制如启动子高/低甲基化、组蛋白修饰或非编码RNA的表达在肿瘤的形成过程中发挥着非常重要的功能。DNA甲基化状态的改变时肿瘤发生发展的重要标志。具有促瘤功能的基因甲基化水平降低而高表达，从而促进多种肿瘤的发生，其中包括胶质瘤。 

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，虽然采取了综合治疗及一些新的治疗手段，其预后仍不理想。一项2010年的统计显示，在美国75％的胶质瘤患者在确诊后5年内死亡。而胶质瘤母细胞瘤的预后更差，一项针对320例胶质母细胞瘤病人的生存分析显示总生存时间为12.3个月，其中91例再次接受手术的病人总生存时间中位数为18.9个月，而未再次手术的患者总生存时间中位数为9.7个月。因此，迫切需要找寻出诊断胶质瘤、判断预后的分子标志物，为提高胶质瘤患者生存率的研究提供依据。 

F10基因(coagulation factor X)定位于染色体13q34，GeneBank登录号：NM_000504。F10基因编码凝血级联中维生素K依赖的凝血因子X(FX)。FX蛋白的双链通过二硫键结合，轻链携带2个EGF样结构域，重链含具有催化功能的结构域，这个结构域与一些有止血功能的丝氨酸蛋白酶在结构上具有同源性。成熟的FX受FIXa剪切而活化(内源性凝血通路)，或者通过FVIIa激活(外源性凝血级联)而成为FXa，继而激活下游通路参与调节凝血功能。目前，有研究者观察了FXa在肿瘤细胞迁移中的功能。但是对于F10基因在胶质瘤中的表达及功能尚未见报道。申请人用免疫组织化学法检测F10基因编码的蛋白FX在正常脑组织及脑胶质瘤组织中的表达，结果显示FX在胶质瘤中表达增加(p＜0.05，图1)，而各级别胶质瘤组织中FX的表达无差异(p＞0.05)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)证实，F10基因在胶质瘤中发生低甲基化(p＜0.01)。然后用SPSS 13.0软件对FX蛋白表达与F10基因低甲基化进行相关性分析，结果表明两者间存在相关性(p＜0.05)，说明表观遗传学可能参与了F10基因的表达调控。 

目前用于检测甲基化状态的方法有亚硫酸氢盐测序PCR法(BSP)、焦磷酸测序、甲基化特异性PCR等，但是利用亚硫酸氢盐测序PCR法分析所获得的肿瘤特异性甲基化状态， 是甲基化分析的金标准，它能明确所测区域每一个CG位点的甲基化状态。 

发明内容

本发明的目的是提供一种低甲基化基因F10的应用方法，对于脑胶质瘤的预后预测具有重要意义。 

低甲基化基因F10用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。 

如：用于制备亚硫酸氢盐直接测序法预测脑胶质瘤的制剂；所述的制剂中包括：根据F10基因转录起始位点上游CpG岛设计的，采用亚硫酸氢盐直接测序法的引物序列为： 

F：5′TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3′， 

R：5′TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3′。 

一种用于人脑胶质瘤预后预测的F10基因转录起始位点上游CpG岛甲基化检测试剂盒，包括以下引物： 

F：5′TTTATTTTTATGTATTAGGGGGTGAG 3′， 

R：5′TACAAACAATCCTAAATCATCAACC 3′。 

申请人发现F10基因编码的蛋白FX在脑胶质瘤组织中表达上调(图1)。F10转录起始位点上游存在CpG岛(图2)，该CpG岛中CG位点在正常的脑组织中均处于高甲基化状态，而在FX表达上调的脑胶质瘤组织中其甲基化程度降低(部分结果见图3)。F10低甲基化的胶质瘤病人总生存率明显低于高甲基化的病人(图4)，提示F10基因是胶质瘤中的低甲基化基因，是预测胶质瘤预后的分子标志。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。 

附图说明

图1FX蛋白在正常脑组织及不同病理分级胶质瘤中的表达； 

A：正常脑组织；B：胶质瘤WHO I级；C：胶质瘤WHO II级；D：胶质瘤WHO III级；E：胶质瘤WHO IV级； 

图2F10基因转录起始位点上游-4490bp至-4110bp为一CpG岛； 

浅蓝色区域为CpG岛，横坐标下红色竖线表示CG位点；