[发明专利]H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒检测领域，尤其是一种H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒。

背景技术

禽流感AI是被动物卫生组织(OIE)列为A类的一种急性烈性传染病，国内也将其列为一类疫病。AI是由禽流感病毒AIV引起的，主要引发禽类的呼吸系统疾病，并以急性发病、高死亡率和产蛋率下降为特征。H6亚型AIV(H6 subtype avian influenza virus)虽然不是高致病性禽流感病毒，但是它在禽类间可以传播，造成禽类的隐形感染，还有可能抗原漂移或转变形成新的毒力更强的毒株，因此早期、快速、准确的诊断十分重要。

常规的禽流感病毒诊断方法有：病毒分离、血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学以及免疫荧光技术(IF)等。然而，这些方法都存在检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、不适合基层活禽市场或者进出口大量样本的检测等。如今，随着进出口品种和类目增加，迫切需要适应基层和边境口岸的简便、快速检测方法及试剂。

环介导的等温核酸扩增在等温条件下，即水浴锅中就可完成扩增反应，不需要特殊仪器设备，如PCR仪等，检验周期很短，在一小时内即可完成反应。反应完成后，可直接通过加入荧光染料，通过肉眼观察就能直接判断反应结果。与其他的检测技术相比，推广应用难度较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测简便快速、灵敏度高、特异性强、仪器要求低、成本低廉的H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，以适应基层和边境口岸现场H6亚型禽流感的检测。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

反应液A：含有10×等温反应缓冲液、AMV 5U/μL、Rnasin 20U/μL、Bst DNA PoLymerase8U/μL、10mM dNTP、25mM硫酸镁、5M的甜菜碱、10μM的外引物1和外引物2、30μM的内引物1和内引物2、40μM的环引物1和环引物2；10×等温反应缓冲液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

外引物1序列为GGGAATCCCCAATGCGAC，

外引物2序列为TCTACTCCTGCCCATGTACT，

内引物1序列为GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT，

内引物2序列为CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT，

环引物1序列为TAGGTCTTTCCACTATAT，

环引物2序列为CACTTATTGGATCAGGAGA；

反应液B：50×SYBR Green I荧光染料。

反应液A每管23μL，其组成为：2.5μL 10×等温反应缓冲液、1.0μL AMV 5U/μL、1.0μL Rnasin 20U/μL、1.0μL Bst DNA PoLymerase 8U/μL、5μL 25mM硫酸镁、3.5μL 10mMdNTP、5μL 5M的甜菜碱、0.5μL 10μM的外引物1和0.5μL 10μM外引物2、1.0μL 30μM的内引物1和1.0μL 30μM内引物2、0.5μL 40μM的环引物1和0.5μL 40μM环引物2；

反应液B每管2μL。

本发明采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术，并根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列(见序列表SEQ.ID.No.1)的保守区八个位点设计了LAMP的6条特异性引物，由此发明了用于快速检测H6亚型禽流感病毒(AIV)的H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒。应用本发明的RT-LAMP试剂盒建立H6亚型禽流感病毒检测方法，通过对家禽咽喉及泄殖腔棉拭子样品的RNA提取，环介导等温扩增、扩增产物的显色检测，从而检测出H6亚型禽流感病毒。该法无需特殊仪器，只需在水浴锅中进行，反应时间短，仅为一个小时，反应完成后，可直接通过肉眼观察判定结果，实现了简便、灵敏、快速地检测H6亚型AIV。因而，特别适合基层和边境口岸现场检测H6亚型禽流感的需要，对该病的防控具有重要意义。

附图说明