[发明专利]有机磷农药生物标志物的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有机磷农药生物标志物的电化学检测方法。利用肟类复活剂对抑制后乙酰胆碱酯酶(AChE)的复活作用，通过酶活性的变化测定有机磷农药生物标志物的含量，用于评估生物体内有机磷农药暴露的情况。

背景技术

大多数有机磷农药(organophosphorous pesticides，OPs)显示出低的环境持久性，但长时间、大面积使用或接触这类农药已经给生态环境和人类健康带来了巨大威胁，对其所产生的生物效应和环境风险进行评价已成为分析化学和农药化学领域最重要的研究内容之一。OPs的毒作用机制是它能与机体内的胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)的活性位点的丝氨酸羟基共价结合，形成磷酰化胆碱酯酶复合物(OP-ChE)，导致酶的活性降低而不能催化水解作为神经递质的乙酰胆碱，使神经传导受阻。目前的检测方法都是通过测定酶活性的降低并于标准值进行比较，来判断有机磷农药的中毒状况。但是，由于个体间胆碱酯酶的含量差异，导致标准值的波动很大，从而对于低剂量有机磷农药暴露无法准确定量。OP-ChE作为有机磷农药生物标志物，为早期监测有机磷农药的接触水平和预测可能的毒性作用提供了新途径。因此，发展快速、灵敏、高效、安全的OP-ChE的检测方法对监测机磷农药暴露十分必要。

肟类化合物，如：解磷定(Pralidoxime，PAM-Cl/I)、双复磷(Obidoxime，DMO4)、双解磷(Trimedoxime，TMB4)，HI-6等，是一类胆碱酯酶复活剂，它们能使乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)中被抑制的酶脱离出来，完全恢复酶的活性，即：复活过程。因此，复活后的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量可作为个体的标准值，避免了个体之间正常AChE的水平差异。基于此思想，申请人提出了一种新的有机磷农药生物标志物的检测方法，分别测量复活前、后AChE的活性，根据两者之间的活性差异，得到对应乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)含量，从而判断农药的接触水平。该方法无需标准AChE含量作为基线，克服了个体差异的影响，为监测低剂量有机磷农药暴露提供了新途径。

发明内容

本发明提出了一种新的有机磷农药生物标志物的检测方法。该方法分别测量复活前、后乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，根据两者之间的活性差异，得到对应乙磷酰化胆碱酯酶加合物(OP-AChE)含量，从而判断农药的接触水平。该方法以复活后AChE含量作为个体自身的基准，消除了个体间正常水平AChE的变异性。

本发明的技术方案：

有机磷农药的电化学检测方法：

第一步：四氧化三铁与金纳米(Fe₃O₄/AuNPs)磁性纳米粒子制备

1)将0.01wt％的四氯化金100mL溶液在搅拌的条件下加热煮沸，随后一次性加入1.0wt％柠檬酸三钠溶液2.5mL，待溶液颜色变成酒红色金胶溶液后，使金胶溶液继续搅拌10min，再停止加热使其冷却至室温，保存于4℃冰箱中备用；

2)取10mg羧基化磁性纳米粒子(Fe₃O₄-COOH)加入到10mL含0.20wt％聚二甲基二烯丙基氯化铵(Poly(diallyldimethylammonium chloride，PDDA)的20mM Tris/NaCl溶液中，超声振荡30min，用磁铁进行磁分离、蒸馏水洗涤，弃去多余的PDDA，得到洁净的PDDA-Fe₃O₄磁性纳米粒子；再把PDDA-Fe₃O₄和50mL步骤1)制备的金胶溶液进行混合搅拌30min，带负电的金纳米粒子自组装到带正电的PDDA-Fe₃O₄纳米粒子表面，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤，配成1mg/mL核壳式Fe₃O₄/AuNPs磁性纳米粒子。

第二步：磷酰化乙酰胆碱酯酶加合物OP-AChE的制备

对氧磷(paraoxon，OP)作为有机磷农药的模型分子，制备乙酰胆碱酯酶加合物(OP-AChE)。