[发明专利]固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法

权利要求书

1.一种固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

①超声萃取：称取牛奶1.7～2.3g，加入0.8～1.5mL¹³C标记的香兰素和0.8～1.5mL 5,6,7,8-D4标记的香豆素，所述¹³C标记的香兰素的浓度为500μg/L，所述5,6,7,8-D4标记的香豆素的浓度为500μg/L，再加入17～23mL的甲醇/水混合溶液，在27～33℃下超声处理25～35min，超声频率为36～38kHz，取出静置，取上层清液，定容，得到待净化液；

②固相萃取净化：取VARIAN BOND ELUT PLEXA C₁₈SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4～6mL待净化液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液淋洗SPE柱，，将SPE柱真空抽干，用8～12mL的甲醇/水混合溶液对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液过微孔滤膜，备用；

③标准溶液的配置：取香兰素、乙基香兰素、香豆素、¹³C标记的香兰素和5,6,7,8-D4标记的香豆素，用甲醇/水混合溶液分别配制成质量浓度为100mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇/水混合溶液，甲醇/水混合溶液中甲醇与水的比例为1:1，稀释上述标准储备液，将香兰素、乙基香兰素、香豆素分别配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50μg/L的混合标准工作溶液，同时将¹³C标记的香兰素和5,6,7,8-D4标记的香豆素配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，10μg/L的混合标准工作溶液；

④测定：将过0.45μm微孔滤膜厚的洗脱液进入LC-MS/MS，采用多反应监测(MRM)模式检测，内标法定量。

2.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步骤①中的加入的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步骤②中的淋洗SPE柱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为2:8，洗脱所用的甲醇/水混合溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于：所述的步骤②中微孔滤膜为0.45μm微孔滤膜。

5.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于：所述的LC-MS/MS的色谱条件如下：

色谱柱：Waters XBridge^TM C₁₈反相柱，色谱柱规格为2.1×150 mm，3.5 μm；

流速：300μL/min；

流动相：A为0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈，A与B的体积比为：55:45；

等度洗脱时间：5min；

进样量：5μL；

色谱柱温度：25～35℃。

6.根据权利要求1所述的固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱法测定牛奶中香兰素、乙基香兰素、香豆素的方法，其特征在于：所述的LC-MS/MS的质谱条件如下：

电喷雾离子源：正离子扫描，电喷雾电压为5000V；

离子源温度：540～560℃；

雾化气压力为47～53psi；

辅助气流速为38～42 psi；

气帘气压力为9～11 psi；

碰撞气压力为18～22 psi。