[发明专利]一种杀虫Bt蛋白Cry8Kb1、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码 基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康 的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济 损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260 亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。农业类害 虫主要集中在鳞翅目与同翅目之中，鞘翅目金龟甲总科内部分昆虫， 如蛴螬，也是重要的世界性分布地下害虫，危害双子叶和单子叶粮 食作物、多种蔬菜、油料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下 的种子及幼苗，并且为害期长，从播种到收获均能为害，造成缺苗 断垄，甚至绝收，还会影响品质。大量调查表明，蛴螬在地下害虫 中为害居首位，占总地下害虫量的70-80％上。主要有暗黑鳃金龟 (Holotrichia parallela Motschulsky)、华北大黑鳃金龟(Holotrichia  oblita faldermann)、铜绿丽金龟(Anomala carpulenta Motsch)等， 在我国华北地区如河北、山东等地危害较为严重。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏 阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫 活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal  crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，该蛋白对 敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt 已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt 还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、 螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害 虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗 虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀 虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了470多种ICPs的基因，根 据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类 和亚类(Crickmore N.，et al.1998.Microbiol Mol Biol  Rev，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。 迄今发现的对蛴螬具有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry18、 cry23、cry37、cry43等类基因(Shu C.，et al.2009.Current  Microbiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8类基因，cry8 类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量为128-137kDa，对金龟 子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有特异的杀虫活性 (Crickmore N.，et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813)。 1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具 有特异杀虫活性的新菌株(Bt.subsp.japonensis BuiBui)(Ohba M.， et al.1992.Letters in Applied Microbiology，14：54-57)，1994年从中克 隆了一种新的杀虫基因cry8Ca(Sato R.，et al.1994.Curr.Microbiol.28： 15-19)。美国Mycogen公司从Bt菌株PS50C分离的Cry8Aa1和 Cry8Ba1对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性(US Patent  5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基 因，发现对马铃薯甲虫，西方玉米根叶甲，南方玉米根叶甲具有显 著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，et al.2002. WO 02/34774 A2)。在我国，河北省农科院植保所和河北农业大学近 年先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(A.exoleta)和铜绿丽金龟(A. corpulenta)的幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株，室内生测死亡率 均达100％(冯书亮等.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金 杆菌新分离株.中国生物防治，2000，16(2)：74-78)。2004年中国农 业科学院植物保护所Bt185分离了一株对暗黑鳃金龟幼虫高效 (LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并从中克隆了四个种新的cry8 类基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前绝大部分此类杀 虫基因均被国外科研究机构或种子公司进行了专利保护；因此，对 这些Bt资源进行挖掘和开发是一项紧迫而又有价值的工作，拥有自 主知识产权，对于基因克隆、工程菌构建和抗虫转基因植物均具有重 要的理论意义和应用价值。