[发明专利]胚胎肺体外培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及哺乳动物的胚胎肺的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肺的离体器官培养。

背景技术

哺乳动物的器官发育研究能够在完整器官的背景下了解多个基本的细胞生物学过程。这在遗传学的时代特别重要，因为哺乳动物如小鼠等中的基因缺失或突变可直接与人类先天畸形相关联。

体外器官培养属于组织培养的一种高级形式，它能再现器官的发育过程，模拟器官在不同状态及条件下的功能状态，是是了解器官发育过程，研究疾病致病机制及药物筛选的重要技术手段。这对于通过分支形态发生机制培养的器官肺特别有用。小鼠胚胎肺的发育始于胚胎9.5天的前肠内胚层喉气管沟的外凸，然后形成芽基逐渐形成支气管分支。这时候每个芽基包含着三层，表皮，包绕的间充质和间皮层，最后形成呼吸系统的肺。而这些分支，分层和肺的器官形成需要例如表皮生长因子(EGF)成纤维生长因子(FGF)等细胞因子和信号通路的调控。为了确定哪些因子对这些过程有影响，早期胚胎肺的体外培养实验体系就应运而生。

目前比较通用的胚胎肺的体外培养体系是基于Trowell 1959年The culture of mature organs in a synthetic medium.Exptl.CeZZ Res.16：118-147，1959.其后许多人对其做了改进，但其核心为利用大口径培养皿(35mm，60mm)，加入适量培养基，将孔径5um左右的聚碳酸脂滤膜漂在培养基上。然后将小鼠胚胎肺放置于滤膜上，置于气液交界处培养(图1、2、3、4)。但是上述方法的使用需要(1)使用聚碳酸脂滤膜等特殊材料，(2)浪费大量的培养皿空间，(3)胚胎肺与培养基的接触面积有限不利于进一步有效的实验干预，(4)并且不利于大规模胚胎肺培养的应用。

发明内容

本发明的目的是解决常规培养方法需要使用聚碳酸脂滤膜等特殊材料，浪费大量的培养皿空间等问题。

本方案解决方案是提供一种哺乳动物胚胎肺的体外器官培养方法，其特征在于包括以下步骤：

a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；

b、将取得的哺乳动物胚胎肺放置于承载片上，加入培养基，使胚胎肺处于培养基和空气的液-气交界面；

c、36℃～38℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。

其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板为标准的24孔培养板(4X 6孔排列，孔直径15.6mm，孔底面积1.9m²)。

其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板仅为液体培养基的承载容器，并不与胚胎肺直接接触，可以使用国产的灭菌的标准24孔培养板。

其中，上述方法步骤a中所述的承载片为透明玻璃圆片。与培养的胚胎肺直接接触，应进行相应的细胞生物学处理。承载片的大小略小于培养孔孔底面积，为培养孔的50-80％大小即可。

其中，上述方法步骤a中在在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。

其中，上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。

其中，上述方法步骤b中所述胚胎肺为分离的胚胎期10～13天的小鼠肺原基。

其中，上述方法步骤b中所述的肺放置方式为：将胚胎肺平放。使得胚胎肺处于培养基的液-气交界处。

其中，上述方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肺位于承载片的中部。

其中，上述方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加4％-16％的新鲜培养基加入培养孔。优选多增加培养基体积一半的8％-13％，最优为10％-12％。