[发明专利]一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。

目前临床应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有：常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动化分析鉴定系统等方法，但是这些方法都存在一定的缺陷：

常规涂片镜检是是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；

培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，是金黄色葡萄球菌诊断和治疗方案的重要依据，目前仍然以培养法为“金标准”，但是非常耗时，不能实现快速的目的；

免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶尔也可引起非特异反应，同时某些含有血浆蛋白结合因子的链球菌和其它个别菌类(例如肠杆菌属的部分菌群)可以非特异地使乳胶颗粒凝集，而出现假阳性。

仪器自动化分析鉴定系统，近年来，相关的革兰氏阳性球菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等，但这些快速鉴定系统大多数是应用于临床革兰氏阳性球菌的鉴定。

常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏，的优势，但是又不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题。

发明内容

本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在，对金黄色葡萄球菌感染的辅助诊断。

本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述试剂盒还包括tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。

优选的，所述试剂盒引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.4；下游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.5；探针核苷酸序列：SEQ ID NO.6。

优选的，所述荧光探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

本发明的有益效果为利用金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在金黄色葡萄球菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1：金黄色葡萄球菌nuc基因灵敏度检测结果图；

图2：金黄色葡萄球菌nuc基因特异性结果图。

具体实施方式

本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA.r beacon)技术对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)基因中高保守特异性核酸序列(nuc基因)进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。

从而指导临床医生对金黄色葡萄球菌感染的病人用药，帮助预后判断。

目的基因nuc的检测：因为nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶基因，所以对nuc基因的检测可以区分金黄色葡萄球菌(SA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的。

所述nuc基因序列如SEQ ID NO.7所示。