[发明专利]一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及汉坦病毒的检测技术，具体涉及一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测试剂及试剂盒。

背景技术

汉坦病毒属（Hantavirus）仅有一个病毒群，即汉坦病毒群（简称汉坦病毒），属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）。根据汉坦病毒基因分子结构和抗原性的不同，将汉坦病毒至少分为34个血清型/基因型，包括汉滩型病毒（Hantaan Virus），汉城型病毒（Seoul Virus），普马拉型病毒（Puumala Virus），多不拉伐型病毒（Dobrava Virus），图拉型病毒（Tula virus），索托帕拉雅型病毒（Thottapalayam virus）和安第斯型病毒（Andes virus）等。汉坦病毒能感染野生啮齿动物和人类，引发人类的肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒性肺综合症（HPS）；这些病遍及亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲等70多个国家，其流行之广，危害之重，已成为全球性的公共卫生问题。我国汉坦病毒的感染情况更为严重，世界汉坦病毒感染每年报告的病例数大约在150,000～200,000之间，而我国发病人数则占世界报道病例数的90％以上，是受汉坦病毒危害最为严重的国家。我国流行的主要是肾综合征出血热，近十年来我国年报告发病人数一直稳定在4～6万人，而且新疫区不断出现，并时有爆发。

汉坦病毒的检测方法主要有病毒分离、血清学检测方法和基因检测方法。基因检测方法主要是反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），与血清学抗体检测相比在灵敏性和特异性上的都大幅度提高。目前汉坦病毒的RT-PCR检测方法中均只针对汉坦病毒中的汉滩病毒型和/或汉城病毒型使用特异性型引物进行RT-PCR检测，如授权公告号为CN101294226的发明专利，就公开了以汉滩型病毒和汉城型病毒的各基因型为目的片断设计了二对引物的试剂盒，用于检测汉滩型病毒和/或汉城型病毒；该试剂盒无法检测出汉坦病毒属内的其它病毒。虽然目前国内疫区大多数为汉滩型病毒和汉城型病毒感染，但随着进出口贸易量的增大，国外流行株（普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、图拉型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒等）传入不可避免，因些防止国外流行株传入以及未知型别病毒的发生的检测显得尤为重要，目前还未有对汉坦病毒属全病毒通用的PCR检测试剂的公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测试剂，该简并RT-PCR检测试剂灵敏性较高，对汉坦病毒群特异性好，不仅可以用于检测国内流行的汉滩型和汉城型病毒，还可以用于检测国外其它流行株，防止国外流行株传入国内。

本发明还提供了由该简并RT-PCR检测试剂组成的试剂盒，该试剂盒为通用的汉坦病毒群的检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测试剂，包括引物，所述引物为一对简并杂合寡核苷酸引物，扩增的目标片段长度为478bp，所述简并杂合寡核苷酸引物的序列分别为：

上游引物G1：5’- GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac - 3’

下游引物G2：5’- CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc -3’。其中r为嘌呤，可以是g或a，y为嘧啶，可以是c或t/u，n是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它，该引物由上海生工合成。

一种由汉坦病毒群的简并RT-PCR检测试剂组成的试剂盒，包括10×PCR缓冲液（PCR buffer）、MgCl₂溶液、dNTP液、Taq酶液、上游引物溶液、下游引物溶液和灭菌去离子水，其特征在于所述上游引物溶液含有上述引物G1，所述下游引物溶液含有上述引物G2，所述MgCl₂溶液的浓度为25mM/L，所述dNTP液的浓度为10mM/L，所述Taq酶液浓度为5U/μL ，所述上游引物溶液中引物G1浓度为25mM/L，所述下游引物溶液中引物G2浓度为25mM/L。该试剂盒中各成份体积可以为100×25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL、MgCl₂溶液1.5μL、dNTP液 0.5μL、Taq酶液0.5μL、上游引物溶液1μL、下游引物溶液1μL和灭菌去离子水16μL，与PCR模板2μL组成的反应体系。