[发明专利]一种检测四环素类药物的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测四环素类药物的试剂盒及方法，具体涉及一种用于检测牛奶样品中四环素类药物的胶体金试纸条及其检测方法。

技术背景

四环素类药物(TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效，可以与大多数药物或饲料添加剂混用，已被广泛应用于畜禽生产中。但过量使用不可避免的造成了严重的药物残留，成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一。为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素类化合物的总量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg。日本肯定列表制度规定奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg。

已报道的四环素类药物残留的检测方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相测定法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳、电化学分析、化学发光、酶联免疫法、胶体金免疫法等，仪器检测方法对待测样品的前处理要求高，操作繁琐，需要精密仪器设备。免疫学方法具有快速、灵敏、特异性高等特点，是四环素类药物残留检测的有效方法之一。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测四环素类药物的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物；四环素类药物特异性抗体可为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物单克隆抗体时，检测区包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物多克隆抗体时，检测区包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。

所述四环素半抗原-载体蛋白偶联物是由四环素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物中的四环素类药物特异性抗体是以四环素半抗原-载体蛋白作为免疫原制备获得。

所述四环素类药物为四环素、金霉素、强力霉素和土霉素。

所述保护膜粘贴样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测区位于靠近有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞；

2)制备具有包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸组装成试剂盒。

具体地说，步骤包括：

1)合成四环素半抗原：取1.1-2.2g四环素，四环素的用量优选为1.1g，0.37-0.75g 4-哌啶甲酸，4-哌啶甲酸的用量优选为0.37g，2-5ml 37％甲醛，甲醛的用量优选为2ml，在50-100ml乙醇中混合，乙醇的用量优选为50ml，在60％微波强度下反应3-5分钟；除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体。

2)将四环素半抗原与载体蛋白偶联，制备四环素类药物-载体蛋白偶联物；

3)用四环素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用四环素半抗原-载体蛋白免疫兔，得到四环素类药物多克隆抗体；

4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将制备的四环素类药物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物；

7)将四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；