[发明专利]利用猪肺提取肝素钠的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药制作技术领域，具体涉及一种利用猪肺提取肝素钠的方法。

背景技术

肝素钠具有阻止血液凝固和溶解血栓的功能，是优良的抗凝血药，自上世纪初被发现以来，广泛应用于治疗心脑血管等药品的生产和化妆品行业中。欧美国家曾从牛肺、羊肝脏中大量提取肝素钠，但后来由于疯牛（羊）病盛行，且多年的实验表明只有从健康生猪脏器中提取出来的肝素才与人体内的肝素分子结构一致，导致猪小肠逐渐成为肝素的主要来源。

目前，我国肝素钠粗品生产多以小肠粘膜作为原料,利用猪小肠粘膜生产肝素钠的小型生化厂有近1500家，几乎每县一家，资源已利用怠尽。肝素动物肺脏中虽然肝素含量高，但由于其组织特异性，存在大量杂质蛋白，肺组织肥大细胞中的蛋白与肝素结合非常牢固，导致不易分离纯化，而难以利用。我国每年出栏生猪约6亿头，猪肺资源十分丰富，对于低廉而滞销的猪肺除少数部分被加工利用外，大部分都没有得到有效利用。猪肺脏中以干物计，含粗蛋白质约70%，油脂16%，碳水化合物4%，因此肝素这种多糖类复合物仅占碳水化合物4%中的一部分，含量并不算很多，如何有效地将肝素提取出来，以及去除一些杂质，以提高粗肝素的纯度，成为当今重要的研究课题。

1933年，Scott等人创立了牛肝肝素分离的传统工艺，效价为3.5u/mg,总活性4200 u/1000g牛肝。1987年台湾林庆文创立了猪肺提取肝素，效价为9.6usp/mg,总活性49029 usp/1000g猪肺。传统工艺包括组织匀浆和自溶，用碱性硫酸铵或氯化钠提取肝素与脂蛋白复台物、乙醇去脂、酶解和沉淀等，传统工艺繁琐，制备的肝素品位低，色泽淡黄，效价低（20u/mg以下），产品收得率低，质量难以保证，生产效益低下而无法规模化生产。

国内也有部分机构在研究提取猪肺肝素，但因其产品提取率极低（每公斤猪肺浆料提取率少于15000国际单位），成本高昂不具备工业化价值，而且其中含有较多类肝素等多硫物和蛋白等杂质，使得产品质量难以达到出售标准而无法规模化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够降低肝素生产成本、提高产品品质和收得率的利用猪肺提取肝素钠的方法。

本发明为实现上述发明目的，采用如下技术方案：利用猪肺提取肝素钠的方法，该方法采用如下步骤：

（1）取新鲜的猪肺绞碎成猪肺浆料，加入0.5-1倍重量的去离子水，再加入细胞裂解剂和防腐剂，加入量分别为猪肺浆料重量的0.1-0.2%和0.1-0.2%，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺浆液；

（2）在上步得到的猪肺浆液中加入1-2.5倍猪肺浆料重量的去离子水，再加入占总液体重量2.5-3.5%的氯化钠，调pH至10-11，搅拌均匀，在25-30℃下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺碱解液；

（3）将上步得到的猪肺碱解液缓慢加热至40-45℃，调pH至8-10，加入占猪肺浆料重量0.05-0.15%的肝素钠复合蛋白酶，搅拌均匀，保温反应2-3小时后，缓慢加温至50-60℃，保温反应2-3小时，得到猪肺酶解液；

（4）将上步得到的猪肺酶解液降温至35-37℃，补加占猪肺酶解液重量10-14%的氯化钠，调pH至9.0-9.5，搅拌均匀，间歇搅拌反应6-8小时，得到猪肺盐解液；

（5）将上述猪肺盐解液加热至80-85℃，保温0.5-1小时，加入占猪肺盐解液重量0.5-1.5%的复合蛋白沉淀剂，搅拌0.5-1小时，静置后收集清液；

（6）用膜浓缩器将清液浓缩至原体积的1/20-1/10，得到浓缩液；

（7）在浓缩液中加入1-1.5倍体积的预冷乙醇，沉淀过夜后吸除乙醇，得到沉淀物，将其用无水乙醇脱水，在50-60℃下真空干燥得到肝素钠粗品。

所述步骤（1）中细胞裂解剂由十二烷基硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中任意两种以上组成。

所述步骤（1）中防腐剂为甲苯或苯酚。

所述步骤（3）中肝素钠复合蛋白酶由胰酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、2709碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶任意两种以上组成。

所述步骤（5）中复合蛋白沉淀剂由珍珠岩晶粉、明矾、碳酸钙、氯化钙、碳酸钡中任意两种以上组成。

所述步骤（7）中乙醇的质量百分浓度为85～90％。