[发明专利]一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法及应用

权利要求书

1.一种微RNA功能的双荧光报告系统的制备方法，其步骤是：

A、自质粒pRSET-B-mCherry上通过PCR扩增获得mCherry基因序列，利用双酶切位点Nhe I和Bgl II，把mCherry基因插入pEGFP-C1载体上，替代pEGFP-C1上的EGFP序列，构建成载体pmCherry-C1；

B、以RNAi-Ready pSIREN-RetroQ质粒为模板，PCR扩增获得U6启动子片段，PCR使用的上游引物：5’-CAACATACGCGTTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC-3’(Mlu I)，下游引物：5’-ATGGATACGCGTGCGGCCGCGACTGATATCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT-3’，PCR扩增条件为：94℃5min，一个循环；94℃45s，60℃50s，72℃30s，进行30个循环；最后72℃延伸5min，扩增的产物经1％∶1克琼脂糖/100毫升水琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带，后用胶回收试剂盒进行回收，取2微克的回收产物及载体pmCherry-C1用Mlu I酶切3小时，用PCR产物纯化试剂盒回收，将Mlu I消化后的pmCherry-C1片段进行去磷酸化处理，37℃1h反应，65℃10min灭活磷酸化酶处理后，将反应产物用PCR产物纯化试剂盒回收，将回收后的酶切PCR产物和经酶切、去磷酸化处理的pmCherry-C1片段以至少摩尔比3∶1比例混合，用T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化E.coli GS500，挑取克隆，提质粒，酶切测序验证，获得phU6-mCherry-C1；

C、将pAdtrack-CMV质粒用Pac I酶切，胶回收试剂盒回收大片段后，再将回收产物用EcoR V酶切，胶回收试剂盒回收小片段，以上述回收产物为模板扩增带有CMV promoter、EGFP ORF及poly A尾的EGFP表达框序列：pAdtrack-CMV  上358-1944位置，使用上游引物：5’-TACACAATCCACTACGTGCGCGTTAAGATACATTGATGAG-3’，下游引物：5’-TACACAAACCACGTAGTGTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3’，PCR扩增条件为94℃5min，一个循环；94℃45s，60℃50s，72℃2min，进行30个循环；最后72℃延伸10min，扩增的产物经1％∶1克琼脂糖/100毫升水琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带，后用胶回收试剂盒进行回收，取2微克的回收产物及载体phU6-mCherry-C1用Dra III酶切3小时后用PCR产物纯化试剂盒回收，将Dra III消化后的phU6-mCherry-C1片段进行去磷酸化处理，将反应产物用PCR产物纯化试剂盒回收，将回收后的酶切PCR产物和经酶切、去磷酸化处理的phU6-mCherry-C1片段以至少摩尔比3∶1比例混合，用T4DNA连接酶16℃过夜连接后转化E.coliGS500，挑取克隆，提质粒，酶切测序验证，获得质粒pMGhU6。

2.权利要求1所述的微RNA功能的双荧光报告质粒pMGhU6在微RNA的抑制功能检测中的应用。