[发明专利]一种地衣芽孢杆菌及其应用

权利要求书

1.一种用于γ-PGA发酵生产的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)P-104，于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4156。

2.一种如权利要求1所述地衣芽孢杆菌P-104在合成γ-PGA中的应用。

3.一种如权利要求1所述地衣芽孢杆菌P-104合成制备γ-PGA的方法，包括以下步骤：

a、采用地衣芽孢杆菌P-104、保藏编号为CGMCC No.4156的菌株作为生产菌株；

b、将上述菌株接在LB培养基固体斜面上培养8-14h；刮取菌苔至无菌甘油保藏管中；在不高于-70℃冷冻条件下保藏；

c、制备种子液：

(1)将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，培养至少24-36h，使其活化；

(2)将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，培养至对数生长中期；

d、发酵培养：

(1)配置发酵培养基：每1L培养基加入谷氨酸钠10-100g；碳源10-100g；无机氮源3-20g；K₂HPO₄·3H₂O 0.1-2g；MgSO₄·7H₂O 0.1-2g；柠檬酸钠2-10g；MnSO₄0.01-0.2g；补充蒸馏水至1000mL，调节pH 6.0-7.5；

(2)将上述发酵培养基投入摇瓶或发酵罐中，高压蒸汽灭菌至少20min后，冷却至30-37℃，按1-5％的接种量接入种子液，培养24-48h；

e、提取：将d中得到的菌株培养液离心除去菌体、收集上清液，并用乙醇或异丙醇沉淀、回收γ-PGA。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，制备种子液步骤(2)时培养8-16h至对数生长中期。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，摇瓶培养时，按50-100mL/500mL三角瓶的装液量投入发酵培养基。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵罐培养时，按发酵罐容积的40-80％投入发酵培养基，搅拌速度为200-600rpm，通气量为0.5-2vvm。

7.如权利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，在发酵罐培养过程中进行补料；补料方式优选加入葡萄糖。

8.如权利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，所述LB固体培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂18g/L，pH7.0；LB液体种子培养基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L，pH7.0。

9.如权利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分还包括NaNO₃、CaCl₂·2H₂O；

所述谷氨酸钠的含量优选30-100g/L；

优选地，无机氮源为硫酸铵、氯化铵或硝酸钠中的一种或几种；含量为5-20g/L；

优选地，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液中的一种或几种；含量为30-100g/L。

10.如权利要求3-9之一所述的方法，其特征在于，各步骤所述的培养优选在30-37℃条件下进行；所述高压蒸汽灭菌优选在115℃下灭菌30min。