[发明专利]牛轮状病毒与牛冠状病毒的检测试剂和制备及应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能快速检测是否被牛轮状病毒与牛冠状病毒感染的分子检测技术，特别是提供了不仅能够分别用于检测牛轮状病毒与牛冠状病毒的分子检测，还可以用于同时检测上述两种病毒的分子检测试剂的制备及其应用，属于动物疫病检测技术领域。 

背景技术

牛腹泻病是养牛业中最常见疾病之一，主要以拉稀便、软便或水样便，呕吐、脱水和体重减轻为主要临床特征。对于犊牛，腹泻可导致新生犊牛生长发育不良和大量死亡，又被称为新生犊牛的杀手。致命的腹泻多侵害生后2周内的犊牛，发病率可达80%，病死率最高可达70%，给养牛业造成巨大的经济损失。因此，如何预防牛腹泻病已成为养牛业的迫切需要解决的重要问题。

根据腹泻发生病因的不同，腹泻可分为传染性腹泻和非传染性腹泻。传染性腹泻是目前大多数养牛场最常见的疾病，而牛轮状病毒（Bovine rotavirus, BRV）和牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV ）是牛发生传染性腹泻的两种重要病原。BRV可引起1～3月龄犊牛和成年严重腹泻，在我国的发病率为60% ～ 80%，给养牛业造成很大经济损失。BCoV是引起10日龄新生犊牛腹泻的一种重要的病原。自美国Mebus等首次报道BCoV以来，随后证明BCoV在世界范围内广泛分布，在我国许多地区牛群中流行。BCoV引起的犊牛腹泻仅次于轮状病毒，并且可导致人的腹泻。

BRV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒基因组为分节段的单股RNA。BRV基因组含有11个片段，共编码6个结构蛋白(VPl～VP4，VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSPl～NSP6)。VP7蛋白由基因片段7、8或9编码，分子量为37Da，由326个AA组成，占病毒蛋白的30％。VP7是BRV外壳的主要糖蛋白和保护性抗原，决定了病毒的G型（C-serotype）。目前已知轮状病毒有16个C型，在牛群中有10血清型被发现，分别为：Gl-G3、G5-G8、G10、G12、G15，其中在全球范围内G6、G10和G8较流行，而我国G10株流行广泛。

BCoV属牛冠状病毒科血清II群成员，病毒基因组为不分节段的单股正链RNA。BCoV基因组5’端有帽子结构，3’端有poly(A)尾，中间包含约10个ORFs，编码约8种蛋白。其中编码的5种结构蛋白，分别为纤突蛋白（Spike protein, S）、膜蛋白（Membrane protein, M）、血凝素-酯酶（Hemagglutinin-esterase, HE）、小膜蛋白（Small membrane protein, SM或E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein, N）。S蛋白是BCoV的主要保护性抗原，能诱导机体产生具有保护能力的中和抗体。在5种结构蛋白中，N蛋白保守性最高。

目前，检测BRV和BCoV常用的实验室方法包括病毒分离法、电镜观察、ELISA等。虽然敏感性和特异性较高，但费时费力；ELISA法虽然敏感性较高，但其缺点是当检测样品存在污染时特异性较差；而且上述方法通过一次试验只能检测一种病原，对这两种病原的混合感染无法进行。随着分子生物学的发展，核酸探针和RT-PCR也逐渐建立起来。RT-PCR方法可以针对不同的靶序列进行快速、准确的诊断，在国内外得到了广泛应用。 

发明内容

 本发明的目的之一在于提供一种利用牛轮状病毒VP7基因与牛冠状病毒N基因保守序列设计合成了2对既能够分别完成又同时完成检测牛轮状病毒与牛冠状病毒分子检测试剂。

本发明的另一目的是提供了上述检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是利用上述分子检测试剂建立能够快速便捷、具有良好的特异性和敏感性及重复性、可分别或同时检测牛轮状病毒与牛冠状病毒的联合RT-PCR检测应用方法。

本发明公开了一种牛轮状病毒与牛冠状病毒的检测试剂，其特征在于包含能扩增牛轮状病毒VP7基因与牛冠状病毒N基因的2对特异性引物， 其中一对是P1和P2引物扩增牛轮状病毒VP7基因片段，扩增长度为519 bp；另一对P3和P4引物扩增牛冠状病毒N基因片段，扩增长度为879 bp；引物序列为：

P1： <210>1；

P2： <210>2；

P3： <210>3；

P4： <210>4。

一种牛轮状病毒与牛冠状病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于主要包括以下步骤：