[发明专利]灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药用生物制品制备方法，尤其涉及一种将从人尿提取的胰蛋白酶抑制剂中所含病毒灭活的方法。

背景技术

人尿胰蛋白酶抑制剂(human Urinary Trypsin Inhibitor，hUTI)是一种从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的糖蛋白，由143个氨基酸组成，SDS-PAGE测得的相对分子质量范围40kDa-45kDa(Eur.J.Biochem.，158，417-422)。其属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶和纤溶酶等多种酶具有抑制作用。此外，其还具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子(MDF)产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。人尿胰蛋白酶抑制剂还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，治疗关节炎，治疗严重急性呼吸综合征，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等(CN102205115A、CN101024075A、CN1751740A、CN1449823A、CN101837121A、CN101954072A、CN101954071A、CN101972471A、CN101020048A和CN101095948A)。

对于人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化的研究已开展几十年，已知的这些纯化方法有阴离子交换色谱、金属螯合树脂分离、超滤、凝胶过滤、亲和性色谱、无机吸附剂处理、盐析、等电点沉淀法、脱乙酰壳多糖吸附和不溶性胰蛋白酶处理等(特开昭51-51579、特开昭51-118810、特开昭51-123810、特开昭55-160724、特开昭56-99427、特开昭57-140728、特开昭60-260518、特开昭61-37736和特开平5-9200)。中国发明专利ZL 200610000200.2和ZL 200610000601.8在特开平5-9200所公开技术的基础上分别提供了一种获得高纯度乌司他丁的方法，所得乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处光吸收值不超过0.2，人尿激肽原酶含量不超过0.0005PNAU，抑制胰蛋白酶的活性不低于3500单位/mg蛋白(凯氏定氮法测定蛋白含量)。

由于人尿胰蛋白酶抑制剂一般从新鲜人尿中分离提取而得，具有被病毒污染的潜在风险。前述这些研究大都集中于对人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化，但是对于其中所可能含有的病毒(如：人免疫缺陷病毒、脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒和肝炎病毒等)去除方面所给予的关注较少。特开昭61-37736公开了一种去除人尿胰蛋白酶抑制剂中所含肝炎病毒的方法，该方法采用在pH2-8(尤以3-5为佳)溶液中60℃加热处理10小时，去除混杂在原料中的病原性肝炎病毒。其结果表明经过10小时60℃加热处理，人尿胰蛋白酶抑制剂在酸性下稳定，而在pH8以上的碱性则表现出不稳定。

除了热处理法(包括干热处理、蒸汽处理和巴斯德加热处理法)以外，其它方法如：有机溶剂/表面活性剂(S/D)处理法、胃蛋白酶处理方法、紫外线照射处理方法、低pH孵化法、纳米膜过滤法和低温乙醇分离法等也可被用于病毒灭活。周锡鹏等人验证了人尿胰蛋白酶抑制剂生产工艺中采用的60℃水浴10小时和乙醇处理3小时的病毒灭活方法(中国生化药物杂志[J]，2009，6，407-410)，虽然具有较好的灭活效果，但有机溶剂(乙醇)会残留在终产品中，进而影响用药的安全。

虽然现有技术已在灭活人尿胰蛋白酶抑制剂所含病毒方面进行了初步研究，但是这些技术或适用于灭活肝炎病毒，或仍对用药安全性产生影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，通过综合运用多种病毒灭活方法，不断调整灭活条件和其它手段相配合，进一步提高病毒的灭活效果。

本发明的另一个目的在于提供一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化过程相配合，在分离过程中实现病毒的灭活。

本发明提供的一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其主要步骤如下：