[发明专利]基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，尤其是一种基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

I群禽腺病毒(fowl adenovirus group I，FAVI)归属于腺病毒科禽腺病毒属，具有共同的群抗原，包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，共12个血清型，代表株为鸡胚致死孤儿(chicken embryo lethal orphan，CELO)病毒。该病在鸡、鸭、鹅体内普遍存在，能使鸡群呈隐性感染，作为继发病原共同作用于家禽，并能垂直传播，污染鸡胚，临床和病理症候群包括包涵体肝炎、再生障碍性贫血、轻度呼吸道疾病和产蛋下降。FAVI较多的是在体内复制而不发病，动物感染该病毒后，呈隐性感染，与其他病原共同作用于家禽。

目前，检测FAVI的血清学方法主要有琼脂免疫扩散、中和试验、免疫荧光、对流免疫电泳、间接血凝反应和Southern杂交等。这些方法耗时、费力，不适合大批量的检测血清样品，而且使用的抗原较多为全病毒，存在散毒的危险。同时，FAVI的灭活苗免疫后，动物体内也会产生蛋白抗体，如何区分FAVI免疫动物和感染动物对防控、净化和消灭该病具有至关重要的作用，然而，目前缺乏区分FAVI免疫动物和感染动物的间接ELISA方法。

目前在疫病防制中采用的灭活疫苗，在制备过程中破坏了绝大多数非结构蛋白，因此用灭活苗免疫动物，理论上动物体内就只有结构蛋白抗体而极少有甚至用现有方法检测不到的非结构蛋白抗体。而动物感染野毒后，病毒在体内复制、增殖的过程中就有非结构蛋白的表达，因此理论上可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分野毒感染动物和灭活苗免疫动物。大量研究表明，利用病毒非结构蛋白建立的ELISA方法能区分野毒感染与灭活苗免疫产生的抗体，Raue R等利用牛病毒性腹泻NS基因建立商品化ELISA试剂盒，以区分野毒感染和灭活苗免疫产生的抗体。我国台湾学者Shu PY等利用乙型脑炎非结构蛋白NS1建立区分感染和免疫抗体的间接ELISA方法。Bruderer U等利用重组蛋白3ABC建立区分口蹄疫自然感染和疫苗免疫的抗体的ELISA方法。Makkay AM等利用新城疫NP基因建立区分自然感染和HN基因亚单位疫苗鸡抗体的ELISA方法。Laviada MD等构建非洲马病NS3基因重组菌，区分自然感染和灭活苗免疫的方法。

33K蛋白是由腺病毒晚期L4区编码的一个非结构蛋白。33K蛋白参与衣壳的形成过程，为空壳病毒粒子的组成成分，但当病毒DNA进入衣壳时，33K蛋白开始被蛋白酶水解。人和动物腺病毒的33K基因较多由2个外显子组成，内含子大小各异。33K作为腺病毒编码RNA的剪接因子，优先激活弱的3’剪接位点序列的转录物剪接。此外，IIIa蛋白是病毒传染相关的剪接增强子，33K通过IIIa充分激活腺病毒的剪切，启动蛋白质装配。因而，3K蛋白在腺病毒感染过程中的重要性日益引起关注。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、简便、适于大批量检测的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，以便于I群禽腺病毒感染的诊断，同时，能够区分I群禽腺病毒感染产生的抗体与灭活苗免疫产生的抗体。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性血清、灭活苗免疫的阳性血清、感染的阳性血清、羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以I群禽腺病毒33K重组蛋白作为包被抗原。

I群禽腺病毒33K重组蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的33K基因片段编码。

I群禽腺病毒33K重组蛋白由基因工程菌株大肠杆菌DH5α体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒pGEX-33K。

I群禽腺病毒33K重组蛋白的制备是以I群禽腺病毒代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后于pGEX-4T-1表达载体连接，构建原核表达载体pGEX-33K，将阳性重组菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达，收集大量表达的重组宿主并超声裂解，用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化得到目的蛋白；特异性引物为

上游引物CCGGAATTCTCTCTCCCTCATTTCT(序列表SEQ.ID.No.2)，

下游引物CCGCTCGAGCTTGATAGCATCGCTCTTC(序列表SEQ.ID.No.3)。