[发明专利]黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。

背景技术

斑皮蠹属害虫是重要的仓储害虫。目前对斑皮蠹的鉴定，主要根据形态学特征进行判别。但由于斑皮蠹类成虫个体一般都比较小，且种间的形态差异不明显，经常造成鉴定中的种间混淆。

皮蠹个体小，成虫体长2.0-3.5mm，且形态酷似不易区分。对成虫的鉴定，主要根据触角棒节数、触角窝深浅、鞘翅颜色及斑纹特点等来鉴别；幼虫体长4.0-6.0mm，一般是根据着生的刚毛数量和类型、第8腹节背板前脊沟是否完整和上内唇感觉乳突的个数等来鉴别。皮蠹的形态鉴别需要解剖后在显微镜下观察，例如两者幼虫最重要的鉴别特征为触角和上内唇，只有0.1-0.2mm大小，而其上的特征，如刚毛和乳突就更加细小，因此稍有不慎就可能将其破坏或丢失。这就不但需要鉴定工作者有丰富的技术经验并且还得保证皮蠹害虫的完整性，从而使得皮蠹近缘种害虫的形态鉴定成为了日益费时费事的难题。

COI基因是动物线粒体DNA中非常保守的编码蛋白基因，它具有相对的保守性同时又有足够的变异，即使是亲缘关系很近的类群也存在几个百分比的差异，所以COI常被用来反映种群遗传变异信息，分析亲缘关系较近的种、种下分类单元等。COI的序列差异性分析在双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、缨翅目等昆虫的鉴别中都被用来作为重要的鉴别依据。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比对更容易操作。目前，COI序列差异性分析已经成为物种间分类最普遍的分子标记之一。

分子生物学技术手段已被用于昆虫的鉴定分类中，目前对皮蠹属近缘种的鉴定，主要采用传统的形态分类学，尽管也有采用PCR扩增片段，通过测序来鉴定的方法，但耗时且费用高，还没有相关的快速分子生物学检测方法。

因此如何能够快速准确的对斑皮蠹进行鉴定，已成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测皮蠹的引物对。

本发明提供的引物对，由引物1和引物2组成；

上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。

上述引物对中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的另一个目的是提供一种检测皮蠹的试剂。

本发明提供的试剂，由上述引物对和AflII组成。

在上述试剂中，所述引物对和所述AflII为独立包装；

在上述试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第三个目的是提供一种检测皮蠹的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，由上述的引物对、dNTP、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

在上述PCR试剂中，所述引物对中的各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.5μM。

在上述PCR试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第四个目的是提供一种检测皮蠹的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的试剂或上述的PCR试剂；

在上述试剂盒中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测皮蠹中的应用也是本发明保护的范围；

上述应用中，所述皮蠹具体为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测皮蠹的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒中的引物对对待测皮蠹进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)分别用AflII酶切步骤1)得到的扩增产物，得到酶切产物，

若所述酶切产物为535bp和347bp大小，则待测皮蠹为或候选为黑斑皮蠹；

若所述酶切产物仍为880bp大小，则待测皮蠹为或候选为花斑皮蠹。

在上述方法的PCR扩增中，以待测皮蠹的基因组DNA为模板；

在上述方法的PCR扩增中，退火温度为50℃-55℃，在本发明的实施例中采用的退火温度为55℃。

在上述方法中，检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

本发明的实验证明，本发明根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。本发明的优点在于：