[发明专利]一种反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种IVF(In Vitro Fertilization，试管受精)单个植入前胚胎的基因表达分析方法，特别涉及以一种利用改良实时定量反转录PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术分析IVF单个植入前胚胎的基因表达方法。

背景技术

1978年7月25日，世界上第一个成功的“试管”婴孩(IVF，体外受精)路易丝喜悦布朗，在英国出生。从此，IVF为全球超过占10％的不孕症夫妇带来了福音。发明IVF的英国科学家罗伯特爱德华兹教授被授予2010年诺贝尔医学生理学奖。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高IVF的成功率。如，2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率(受孕率)在25-30％左右，而1997年也在30％左右。而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量。这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。

目前，选择植入母体的囊胚期胚胎主要是根据胚胎的形态学特性。而迄今尚未有一种特殊的生物学标记及监测手段来确定培养液和胚胎质量。胚胎质量与胚胎学家的经验密切相关。这种人为的选择实际上存在潜在的危险性。因为即使有优良形态学特性的胚胎仍可能存在基因突变和缺陷。如Sirtuins蛋白通过调节线粒体能量代谢功能，在IVF植入前胚胎期发挥了重要的作用。Sirt3基因的缺陷诱导了肿瘤抑制蛋白trp53的表达而抑制了胚胎的发育。如果sirt3基因和trp53基因同时缺陷，可改善胚胎的发育。这种情况也可见于单独trp53基因缺陷时，而胚胎表现为正常的形态学特性。在利用实时定量反转录PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chainsreaction)方法检测小鼠受精卵体外培养72-96小时后的胚胎发现一组胚胎中总的肿瘤抑制基因trp53mRNA总量明显低于体内生长的同期胚胎。RNA微阵列(RNA Microarray)也显示小鼠一组IVF囊胚期胚胎明显比体内生长的囊胚期胚胎表达了低的trp53mRNA。目前尚未知道这组胚胎中有多少个胚胎不表达trp53，如果这个trp53基因缺陷的胚胎植入至母体，下一代的肿瘤发生率无疑将大大增高。Microarray显示小鼠受精卵体外在Whitten氏培养液和KSOM+氨基酸培养液培养96小时所形成的囊胚期胚胎分别有114和29个基因表达异常。我们对目前临床常用的三种IVF培养液中生长成的小鼠囊胚期胚胎的分析显示52-102个基因表达异常，异常程度非常不同，而且影响了许多关键的细胞功能和重要器官的发育。例如：1.决定干细胞潜能性的转录因子，Nanog和UTF1；2.干细胞分裂和维持功能；3.心室肌细胞的发育，肺泡细胞的发育，大脑皮层神经元的分化和突触的发育；4.B淋巴细胞的分化；5.细胞对DNA损伤的反应；6.细胞清除极低密度脂蛋白的能力，等等。这说明目前临床常用IVF培养液可能存在缺陷，也就是说迄今我们尚未有最理想的IVF培养液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段来监测IVF培养液的质量。

虽然微阵列(Microarray)分析提供了强有力的工具来分析单一实验过程中成千上万个基因的表达。然而它并不适合于样品的RNA量相当小的时候(对于Microarray，通常每个样品至少需要50ng RNA，我们的经验需要100个以上囊胚期胚胎)。这不可能用人类单个IVF病例的100个囊胚期胚胎作Microarray分析，换句话说，Microarray目前并不能作为人类检测IVF胚胎的基因表达的手段。另一种重要的情况是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表达形式差别很大，尤其当被测基因的RNA转录子的丰度低，而且它的转录子寿命又较短，而这种特性可能在调节植入前胚胎期功能发挥了关键的作用，这种瞬时表达的基因用Microarray分析技术也不易监测到。

发明内容

为解决RNA Microarray在基因表达分析中的不足，本发明提供了一种改良的实时定量反转录PCR，这是一种有效的用于分析基因在单个细胞和单个植入前期胚胎表达的方法。这种改良的实时定量反转录PCR技术操作要求相当高，但非常敏感，高度精确，同时能产生可观的资料。利用这种方法，可以弥补Microarray的不足，对分析单个关键基因在单个细胞的表达和在IVF科研与临床上有非常广泛的应用价值。这种技术还提供了有效的方法去检测那些潜在重要的瞬时表达的RNA转录子，和怎样估价并且解释在总RNA池完成的基因表达分析的结果，不至于掩盖那些相对稳定表达的转录子的重要信息。