[发明专利]可用于结核分枝杆菌感染检测的表位多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原Rv3615c的抗原表位多肽。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，据WHO资料估计，全球三分之一的人口受结核分枝杆菌感染，每年新发活动性感染病例九百多万，死亡一百万例以上。近年来，我国结核病发病率居高不下，每年新发病例超过一百万，死亡近二十万例，对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重危害。

结核病的早期诊断对于控制患者疾病进展和疾病的传播具有重要意义。目前，结核病临床诊断仍然缺乏高灵敏度和高特异性的手段。传统的结核菌素皮下试验所用的抗原结核菌素因为能够跟卡介苗(BCG)接种产生交叉反应使得其产生较高比例的假阳性，而临床诊断的“金标准”——结核分枝杆菌培养，则有时间长，阳性率低等缺陷。另外，基于X射线透射和临床表现的诊断则特异性较低，容易与其他肺部感染或疾病相混淆。

结核分枝杆菌感染人体突破天然免疫屏障后，被感染细胞内一些结核分枝杆菌抗原可以被细胞内蛋白酶体切割成不同长度的多肽，其中8-11个氨基酸长度多肽可以通过人抗原处理相关转运蛋白(TAP)转运至内质网中，并与人白细胞抗原(HLA)I类分子结合形成复合体，共同呈递到细胞表面，通过与T细胞相互识别，从而使得感染细胞的病原体能够被特异性的杀伤性T细胞杀伤并清除。一个抗原往往包含多个HLA限制性表位多肽，从而使得该抗原能够被不同遗传背景人群所识别。通过抗原中不同HLA限制性表位多肽的鉴定，一方面，这些短的表位多肽可以直接结合于HLA分子，用于T细胞免疫为基础的检测减少了细胞内加工过程，能够提高检测效率；另一方面，表位多肽用于疫苗设计能够避免因使用细菌全抗原产生的毒副作用。

目前，通过结核分枝杆菌与BCG菌株基因组的研究比较发现了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段，称为RD区，针对其中RD1区编码的蛋白ESAT-6和CFP-10的特异性T细胞分泌产生的γ-干扰素(IFN-γ)的检测(IGRAs)，催生了两种商品化结核感染诊断试剂盒，即基于酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的T-SPOT.TB(Oxford Immunotech，Abingdon，United Kingdom)和基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的QuantiFERON-TB Gold(Cellestis，Carnegie，Australia)。目前，这两种诊断试剂盒已经得到美国FDA批准上市，作为结核感染临床诊断的辅助手段。

然而，由于专利权的保护，使得我国引进相关产品进行临床诊断时成本极高且不适合我国特殊的流行病学现状，不适用于广泛推广，并且以ESAT-6和CFP-10为抗原的诊断试剂开发都难以逃避这两种抗原的专利保护。因此获得具有较高的灵敏度和特异性的可用于结核分枝杆菌感染或者结核病的抗原，是目前急需解决的问题。

发明内容

最新研究表明，Rv3615c抗原具有较高的T细胞免疫原性，其反应强度与ESAT-6和CFP-10相比较水平相当，且只在结核分枝杆菌感染者体内有反应，因此可能是一个较好的结核特异性诊断抗原。本发明的目的在于通过生物信息学预测Rv3615c抗原中包含的杀伤性T细胞(CTL)表位，并通过结核病例的反应情况，筛选得到一系列中国人群中常见白细胞抗原(HLA)A位点分子限制性表位。根据这些表位多肽在结核病例及健康志愿者中的反应强度和检测灵敏度，并结合其在健康志愿者中的反应情况，提供一种能够用于结核分枝杆菌感染检测的抗原表位多肽组合。

本发明要解决的技术问题是提供几种结核分枝杆菌特异性的抗原表位多肽多肽，其氨基酸序列为(a)或(b)或(c)所示。

(a).所述多肽的氨基酸组成如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示。

(b).(a)中所述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与结核分枝杆菌的CTL表位相关的由序列(a)衍生的多肽。

(c).与(a)(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

含有权利要求1所述多肽编码DNA的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述抗原表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒中的应用也属于本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种结核分枝杆菌特异性T细胞检测试剂盒，含有所述多肽或所述多肽的编码DNA分子或根据他们衍生出的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。